曹勇，王東旭，孫妍，楊俊，張營，鄭長清

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第二消化內(nèi)科，沈陽 110004）

炎癥性腸病 （inflammatory bowel disease，IBD）是腸道的慢性非特異性炎癥性疾病，主要包括2種獨(dú)立性疾病，即克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎 （ulcerative colitis，UC） 。疾病以藥物治療和外科干預(yù)為主，但容易反復(fù)發(fā)作。如何干預(yù)其炎癥的發(fā)生和進(jìn)展，是目前臨床研究的主要方向。腸黏膜屏障功能異常在IBD發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。腸黏膜屏障功能異常時，腸道上皮層缺損、腸道通透性增加、黏膜屏障破壞、損傷、潰瘍。自噬作為真核細(xì)胞中高度保守的維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)微環(huán)境改變的一種方式，其改變與IBD息息相關(guān)。自噬是細(xì)胞在外界條件變化、各種理化因素改變及不利因素刺激時發(fā)生的一種保護(hù)性機(jī)制。自噬可將胞內(nèi)“廢物”如變性的蛋白質(zhì)、老化及受損的細(xì)胞器、甚至病原微生物運(yùn)輸?shù)饺苊阁w降解，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的循環(huán)再利用，并維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。目前有研究［1］表明，腸道上皮細(xì)胞自噬的降低可以導(dǎo)致自噬清除細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的功能障礙，炎癥環(huán)境下腸道上皮細(xì)胞的黏附能力下調(diào)，黏膜屏障功能受損。

隨著基因組計劃的完成，在人類基因中雖然非編碼RNA并不參與蛋白編碼，但卻能夠通過影響編碼的過程調(diào)控蛋白的表達(dá)，從而影響各種生物學(xué)行為。microRNA （miRNA） 作為非編碼RNA中的一員，可以從轉(zhuǎn)錄后水平影響蛋白的合成。近年來多項研究［2-4］表明，多種miRNA在UC患者的腸道組織、血清、糞便中異常表達(dá)。miRNA可通過對下游靶基因表達(dá)的調(diào)控，影響機(jī)體免疫系統(tǒng)的發(fā)育和分化，參與機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)。此外，miRNA在細(xì)胞自噬發(fā)生過程的不同階段中也起到重要的作用［5-7］。但miRNA是否參與UC的自噬異常，目前鮮有報道。本研究通過實(shí)時PCR、Western blotting、流式細(xì)胞技術(shù)以及細(xì)胞轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)手段，證實(shí)了miR-26a在UC組織中呈高表達(dá)趨勢，且miR-26a能夠促進(jìn)UC細(xì)胞的自噬發(fā)生，從而為UC的病因預(yù)防、早期診斷、有效治療提供理論依據(jù)及新的思路。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集和研究對象

30例組織樣本選取自2016年1月至2017年10月間于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院診斷為UC的患者，其中男性19例，女性11例，年齡20～65歲，中位年齡39.4歲。同時選取相同時間段內(nèi)結(jié)腸鏡和顯微鏡檢查排除UC的正常對照者30例，其中男17例，女13例，年齡23～67歲，中位年齡44.5歲。所有受試者均簽署知情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會審核。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

細(xì)胞選用人類結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系Caco-2 （中國科學(xué)院細(xì)胞研究所） ，細(xì)胞密度保持在1×105/mL，培養(yǎng)基選用DMEM+10%胎牛血清，培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的條件下。將Caco-2細(xì)胞接種于6孔板，分為miR-26a mimics轉(zhuǎn)染組、miR-26a inhibitors轉(zhuǎn)染組及空載質(zhì)粒組；待細(xì)胞融合至70%～80%，應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000分別將空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。按照說明書，250 μ L無血清培養(yǎng)基分別加入5 μ g DNA及5 μ L脂質(zhì)體Lipofectamine 2000，混勻室溫靜置5 min，混合2管溶液并室溫放置10 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，孵箱培養(yǎng)4～6 h后更換為含10%胎牛血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)時PCR

按照Invitrogen公司的Trizol reagent說明書，從上述組織及培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，應(yīng)用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，共40個循環(huán)，以U6小核RNA為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt方法定量，計算 miR-26a 的相對表達(dá)量。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

應(yīng)用預(yù)冷PBS清洗上述各組細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，收集5×106個細(xì)胞。加入500 μ L Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μ L FITC標(biāo)記的Annexin-V （20 μ g/mL） 混勻，加入5 μ L混勻；室溫避光5～15 min，即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 Western blotting

細(xì)胞蛋白提取使用M-PER哺乳動物蛋白提取試劑盒 （美國Pierce Biotechnology公司） 。蛋白濃度測定使用BCA 蛋白試劑盒 （美國Pierce Biotechnology公司） ，蛋白質(zhì) （100 μ g） 采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上 （美國Millipore公司） 。然后5%脫脂牛奶和TBST室溫下培育2 h，用封閉液封閉2 h或4 ℃封閉過夜；分別加入一抗LC3Ⅱ、 p62、 β-actin，4 ℃溫育過夜，TBST 洗3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗 （1∶2 000） 室溫孵育2 h；TBST洗3次，每次10 min；加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑A、B各1 mL，暗室中進(jìn)行顯影。應(yīng)用Image J軟件分析圖像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 UC中miR-26a呈高表達(dá)

提取UC患者組織及血清中總RNA，以正常對照者為對照組，應(yīng)用實(shí)時PCR檢測miR-26a相對表達(dá)情況，結(jié)果顯示，UC患者組織及血清中miR-26a表達(dá)明顯高于正常對照者 （P ＜ 0.05） 。見圖1。

2.2 miR-26a對Caco-2細(xì)胞凋亡的影響

在Caco-2細(xì)胞系中應(yīng)用miR-26a mimics及miR-26a inhibitors過表達(dá)/敲低miR-26a的表達(dá)，應(yīng)用實(shí)時PCR檢測轉(zhuǎn)染效率 （P ＜ 0.05，圖2A） ，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測 Caco-2細(xì)胞凋亡情況。Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-26a mimics 48 h后，細(xì)胞轉(zhuǎn)染組凋亡率為（14.5±1.74） %，明顯高于對照組的凋亡率 （5.2±1.1） %，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05，圖2B） 。Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-26a inhibitors 48 h后，細(xì)胞轉(zhuǎn)染組凋亡率為（3.1±0.87） %，明顯低于對照組的凋亡率 （5.8±1.2） %，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05，圖2C） 。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-26a過表達(dá)可明顯促進(jìn)Caco-2細(xì)胞凋亡。

圖1 實(shí)時PCR檢測UC患者和正常對照者組織及血清中miR-26a的相對表達(dá)Fig.1 miR-26a expression in the tissue and serum samples of patients with ulcerative colitis and normal controls was determined using real-time PCR

2.3 miR-26a對Caco-2細(xì)胞自噬的影響

圖2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測miR-26a對Caco-2細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-26a on apoptosis of Caco-2 cells was detected by flow cytometry

應(yīng)用Western blotting分別檢測過表達(dá)/敲低miR-26a的Caco-2細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p62。與空載質(zhì)粒組相比，過表達(dá)miR-26a后，Caco-2細(xì)胞的LC3-Ⅱ表達(dá)明顯降低，且p62表達(dá)明顯升高，結(jié)果表明，過表達(dá)miR-26a抑制了Caco-2細(xì)胞自噬的發(fā)生 （P ＜ 0.05，圖3A） 。而敲低miR-26a表達(dá)后，Caco-2細(xì)胞的LC3-Ⅱ表達(dá)明顯升高，且p62表達(dá)明顯降低，結(jié)果表明，敲低miR-26a表達(dá)促進(jìn)了Caco-2細(xì)胞自噬的發(fā)生 （P ＜ 0.05，圖3B） 。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-26a與Caco-2細(xì)胞自噬激活呈正相關(guān)。

圖3 Western blotting檢測過表達(dá)/敲低miR-26a的Caco-2細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p62蛋白表達(dá)Fig.3 Effect of miR-26a overexpression/knockdown on LC3-II/LC3-I and p62 expression in Caco-2 cells was detected by Western blotting

3 討論

UC是腸道的慢性非特異性炎癥性疾病，屬于IBD的一種。正常情況下，腸上皮細(xì)胞構(gòu)成腸道物理屏障，上皮細(xì)胞間的緊密連接有助于腸道細(xì)胞的穩(wěn)定并對抗共生細(xì)菌的可靠屏障。腸上皮細(xì)胞調(diào)節(jié)失調(diào)會損害屏障功能，導(dǎo)致細(xì)胞外滲增加和抗原暴露，繼而造成持續(xù)有害刺激，急性炎癥可能成為慢性炎癥［8-9］。在此過程中，往往伴隨著腸上皮細(xì)胞miRNA表達(dá)的改變，說明miRNA在此過程中起到了重要的作用［4，10-13］。SCHAEFER等［14］在IBD患者的唾液中測試了miRNA的概況，發(fā)現(xiàn)miR-101在克羅恩病患者唾液中表達(dá)升高，而miR-21、miR-31和miR-142在UC患者中升高。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a的表達(dá)在UC患者組織及血清中明顯升高。UC的腸黏膜屏障功能失調(diào)是多個環(huán)節(jié)、多個因素共同導(dǎo)致的，最終使腸道免疫失衡［15］。

目前的研究［16］表明，UC發(fā)生時，腸道上皮細(xì)胞往往伴隨著凋亡增加，最終造成腸上皮通透性增加和腸上皮屏障損傷；而同屬于程序性壞死形式的自噬，是細(xì)胞受到外界條件變化、各種理化因素改變及不利因素刺激時發(fā)生的一種保護(hù)性機(jī)制。在IBD患者腸道上皮的屏障功能失調(diào)過程中，自噬往往具有重要作用［17］。研究等［18］發(fā)現(xiàn)，在IBD患者的腸上皮細(xì)胞中，miR-196能夠通過調(diào)節(jié)IRGM的表達(dá)，抑制自噬，最終導(dǎo)致腸道上皮屏障功能的失調(diào)。有研究［19］表明，自噬相關(guān)基因ATG16L1基因單核苷酸多肽性位點(diǎn)rs2241880 （T300A） 與歐美人群IBD發(fā)病相關(guān)。亦有研究［20-21］表明中國和韓國人群IBD發(fā)病亦與T300A相關(guān)，提示T300A可能在亞洲IBD患者的易感性中發(fā)揮作用。近期PAIVA等［22］發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸組織中自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ和p62的表達(dá)與UC患者行復(fù)原性全結(jié)直腸切除并回腸儲袋肛管吻合術(shù)后并發(fā)儲袋炎相關(guān)。上述研究均表明，腸上皮細(xì)胞自噬的異常與UC的黏膜屏障功能異常息息相關(guān)。

為了探究miR-29a是否參與了UC相關(guān)腸上皮細(xì)胞的自噬失調(diào)，本研究過表達(dá)/敲低Caco-2細(xì)胞的miR-29a的表達(dá)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測Caco-2細(xì)胞凋亡情況，應(yīng)用Western blotting檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p62的表達(dá)情況。結(jié)果表明，過表達(dá)組Caco-2細(xì)胞的凋亡明顯增加，而自噬明顯減少；敲低組Caco-2細(xì)胞的凋亡明顯減少，而自噬明顯增加；這些結(jié)果表明，miR-26a確實(shí)能夠抑制UC相關(guān)腸上皮細(xì)胞的自噬。而miR-26a是否通過抑制UC相關(guān)腸上皮細(xì)胞自噬進(jìn)而使腸上皮細(xì)胞黏膜屏障功能失調(diào)，還需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

綜上所述，UC的發(fā)生、發(fā)展與miR-26a的表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)，但其中具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)，進(jìn)而為UC的臨床治療提供潛在的理論支持。