徐國帥，蔡相軍，陳江波，呂慶，劉洪濤

（1. 中國人民解放軍第202醫(yī)院普通外科，沈陽 110812； 2. 中國醫(yī)科大學研究生院，沈陽 110122）

胃癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率位于第5位，并且是全球癌癥相關(guān)性死亡的第三大原因［1］。大多數(shù)患者診斷出胃癌時已經(jīng)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者遠處轉(zhuǎn)移，還有部分患者經(jīng)手術(shù)治療后復(fù)發(fā)，胃癌術(shù)后的5年生存率只有30%左右［2］。因此，研究胃癌相關(guān)基因，有助于了解胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機制，可以對胃癌患者進行有效的靶向治療并延長患者的生存時間。AEG-1首次在感染HIV-1的人胚胎星形膠質(zhì)細胞中發(fā)現(xiàn)［3］。AEG-1能夠促進細胞增殖、代謝、遷移、侵襲以及血管生成等，因此AEG-1的表達升高與多種腫瘤的臨床分型、分期、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)［4-5］。CHD5是定位于人染色體lp36的抑癌基因，它能夠調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑，達到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用［6］。本研究探討AEG-1與CHD5在胃癌中的聯(lián)系，并且研究其表達情況與胃癌患者臨床病理特征和術(shù)后生存率的關(guān)系，為胃癌患者提供新的預(yù)測生存率的指標和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取中國人民解放軍第202醫(yī)院普外科胃腸病區(qū)2012年1月至2013年1月收治的病歷資料完整詳細且病理確定為胃癌的患者58例。根據(jù)病歷號，分別獲取同一病例癌組織蠟塊和癌旁組織蠟塊 （距離腫瘤邊緣＞5 cm） 。全部病例均實施開腹胃癌根治術(shù)，術(shù)前均未進行放化療治療，且征求患者及其家屬意見，自愿參與本研究，征得隨訪同意。其中，男性患者44例，女性患者14例。年齡32～82歲，平均年齡63.05歲，中位年齡63歲。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，未轉(zhuǎn)移18例。根據(jù)2009年第7版國際抗癌聯(lián)盟胃癌TNM分期［7］：Ⅰ期15例，Ⅱ期15例，Ⅲ期24例，Ⅳ期4例。分化程度：低分化26例，中分化及高分化32例。Lauren分型：腸型31例，彌漫型27例。腫瘤直徑≥5 cm 18例，直徑＜5 cm 40例。

1.2 試劑及儀器

兔抗人AEG-1多克隆抗體 （ab45338） 與兔抗人CHD5多克隆抗體 （ab202132） 購自英國Abcam公司。兔SP檢測試劑盒 （SP-9001） 及DAB顯色液試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

采用免疫組化SP法，測定AEG-1和CHD5在胃癌組織及癌旁組織中的表達情況。標本石蠟塊切片，所切標本在75 ℃恒溫箱中放置6 h，取出后自然冷卻。切片脫蠟、水合，3%過氧化氫溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶，置入高壓水浴鍋內(nèi)的枸櫞酸鈉緩沖液中進行熱修復(fù)，滴加山羊血清封閉液，靜置20 min后，分別滴加AEG-1抗體 （1∶400） 與CHD5抗體 （1∶100） 。陰性對照滴加PBS溶液代替一抗，切片在4 ℃下過夜。復(fù)溫、洗片后滴加二抗及辣根酶標記鏈霉卵白素，孵育后滴加顯色液，沖洗、蘇木素復(fù)染、脫水，最后用中性樹膠蓋片。

1.4 結(jié)果判定

由3名病理科醫(yī)師在400倍的光學顯微鏡下隨機觀察5個視野，每個視野要求至少計數(shù)100個完整腫瘤細胞。腫瘤細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色染色為陽性，以陽性細胞比例得分乘以染色強度得分為最終評判得分。在統(tǒng)計分析中，最終得分≥6分為高表達，＜6分為低表達。陽性細胞比例評分：＜5%為0分，5%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，50%～＜75%為3分，≥75%為4分。染色強度評分：未染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。

1.5 隨訪

隨訪自手術(shù)之日開始，術(shù)后第1、2年每3個月隨訪1次，術(shù)后3～5年每6個月隨訪1次。隨訪方式為門診復(fù)查、電話和微信等方式，隨訪截止時間為2018年1月2日。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料應(yīng)用行×列聯(lián)表的χ2檢驗；AEG-1與CHD5的相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman相關(guān)分析；生存曲線的繪制應(yīng)用Kaplan-Meier法，其檢驗方法采用log-rank法；應(yīng)用Cox比例風險回歸模型對胃癌患者進行影響預(yù)后的多因素分析。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與其對應(yīng)的癌旁組織中AEG-1與CHD5的表達

AEG-1的染色部位位于細胞質(zhì)與細胞膜，見圖1；CHD5的染色部位位于細胞質(zhì)與少量細胞核，見圖2。AEG-1在胃癌組織中與對應(yīng)的癌旁組織中高表達率分別為74.14% （43/58）和37.93% （22/58）；CHD5在胃癌組織中與對應(yīng)的癌旁組織中高表達率分別為32.76% （19/58）和70.69% （41/58） 。在胃癌組織中AEG-1的表達顯著高于癌旁組織 （χ2=22.356，P ＜ 0.05） ，而CHD5在癌旁組織中表達明顯高于胃癌組織 （χ2=16.710，P ＜ 0.05） ，差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 AEG-1與CHD5蛋白表達與胃癌患者臨床病例特征的相關(guān)性分析

AEG-1蛋白表達水平與患者的性別、年齡、分化程度、腫瘤直徑大小無關(guān) （P ＞ 0.05） ，而與患者的TNM分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Lauren分型有關(guān) （P ＜ 0.05） 。CHD5蛋白表達水平與患者性別、年齡、腫瘤直徑大小、浸潤深度、Lauren分型無關(guān) （P ＞0.05） ，而與患者的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上有關(guān) （P ＜ 0.05） 。見表1。

圖1 AEG-1的表達 ×400Fig.1 AEG-1 expression ×400

圖2 CHD5的表達 ×400Fig.2 CHD5 expression ×400

2.3 胃癌組織中AEG-1與CHD5表達的相關(guān)性

胃癌組織中AEG-1高表達43例，低表達15例，CHD5高表達19例，低表達39例。兩者均高表達7例，均低表達3例。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌組織中AEG-1與CHD5蛋白表達水平呈現(xiàn)顯著的負相關(guān) （r = -0.595，P ＜ 0.001） ，見表2。

2.4 AEG-1與CHD5在胃癌患者中的表達與預(yù)后

53例患者隨訪時間為3～60個月，其中5例患者失訪，隨訪率為91.38%。應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，AEG-1高表達組5年生存率為28.95%，AEG-1低表達組5年生存率為73.33%，見圖3。Logrank檢驗結(jié)果顯示，2組間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.644，P = 0.018） 。CHD5高表達組5年生存率為77.78%，CHD5低表達組5年生存率為22.86%，見圖4。log-rank檢驗結(jié)果顯示，2組間差異有統(tǒng)計學意義 （χ2=7.643，P = 0.006） 。

2.5 Cox比例風險回歸模型對胃癌患者生存率影響的多因素分析

應(yīng)用Cox比例風險回歸模型分析患者的年齡、性別、TNM分期、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Lauren分型、AEG-1表達情況和CHD5表達情況8個協(xié)變量，發(fā)現(xiàn)TNM分期、腫瘤分化程度、AEG-1表達情況與CHD5表達情況是影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素。見表3。

3 討論

近年來，胃癌的腫瘤分子生物學研究發(fā)展迅速，科研人員力求從分子水平闡釋胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制，從而尋求合適的分子生物學指標進行預(yù)后評估或者靶向治療［8-9］。在本研究中，AEG-1在胃癌組織中的高表達率為74.14%，顯著高于癌旁正常組織。并且進一步研究發(fā)現(xiàn)，AEG-1的表達與患者的TNM分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Lauren分型有關(guān)。因此，AEG-1的異常表達會影響腫瘤細胞增殖、侵襲等生物學行為。這與WU等［10］的研究結(jié)果一致。WU等［10］發(fā)現(xiàn)AEG-1的表達升高與胃癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且AEG-1能夠促進胃癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲。還有研究［11］發(fā)現(xiàn)，AEG-1在腫瘤壞死因子α的介導下易位到細胞核，與NF-κ B的p65亞基相互作用，并作為NF-κ B與轉(zhuǎn)錄機制間的橋接因子。這種相互作用增強了NF-κ B下游基因的轉(zhuǎn)錄，導致血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。

表1 胃癌患者AEG-1與CHD5在不同病理特征中的表達Tab.1 AEG-1 and CHD5 expressions in patients with different pathological characteristics of gastric cancer

表2 胃癌組織中AEG-1與CHD5表達的相關(guān)性（n）Tab.2 Correlation between AEG-1 and CHD5 expressions in gastric cancer（n）

CHD5是人類腫瘤中重要的抑癌基因，在染色質(zhì)重塑過程中發(fā)揮重要作用［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，CHD5在胃癌組織中呈現(xiàn)低表達，并且其表達情況與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，CHD5能夠誘導腫瘤細胞發(fā)生增殖、侵襲、凋亡等行為，進而對腫瘤的發(fā)展產(chǎn)生影響。CHD5最重要的信號通路是ARF/P53，p53能夠促進細胞凋亡機制的發(fā)生，并且起到穩(wěn)定NF-κ B的轉(zhuǎn)錄而誘導細胞的凋亡的作用［13］。CHD5基因作為ARF/P53通路的上游基因，起到了重要的門戶作用，一旦CHD5基因突變或缺失將引起其下游一系列靶基因功能喪失，從而導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展［14］。AEG-1能夠激活并促進NF-κ B信號通路進行轉(zhuǎn)錄，而CHD5則在上游抑制、穩(wěn)定NF-κ B信號通路，這與本研究得出的相關(guān)分析結(jié)果相同，在胃癌組織中AEG-1與CHD5之間表達情況呈顯著負相關(guān) （r = -0.595，P ＜ 0.001） 。但本研究仍有不足，只探討了AEG-1與CHD5在NFκ- B通路上的關(guān)系，在其他信號通路上的關(guān)系還尚不清楚，仍需深入研究。

圖3 AEG-1表達水平與胃癌患者的預(yù)后關(guān)系Fig.3 Relationship between AEG-1 expression and gastric cancer prognosis

圖4 CHD5表達水平與胃癌患者的預(yù)后關(guān)系Fig.4 Relationship between CHD5 expression and gastric cancer prognosis

表3 Cox比例風險回歸模型對胃癌患者預(yù)后影響的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of the prognosis of patients with gastric cancer by Cox proportional hazard regression model

通過隨訪和生存分析發(fā)現(xiàn)，AEG-1高表達組5年生存率明顯低于低表達組，CHD5高表達組5年生存率高于低表達組。多因素分析發(fā)現(xiàn)，TNM分期、腫瘤分化程度、AEG-1與CHD5的表達情況是影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素。這些結(jié)果均提示AEG-1和CHD5與胃癌患者預(yù)后顯著相關(guān)，有可能成為一種新的評估胃癌患者預(yù)后價值的標志物。

綜上所述，胃癌的發(fā)生和發(fā)展受多種信號通路的影響，是一個復(fù)雜而又精密的過程。了解胃癌發(fā)生發(fā)展的機理，從根本上解決胃癌細胞在分化過程中的關(guān)鍵問題，是改善胃癌患者預(yù)后的重要途徑。AEG-1和CHD5與胃癌的侵襲、浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，聯(lián)合檢測更有利于胃癌的早期診斷及預(yù)后判斷，有望成為胃癌治療的新靶點。