萬(wàn)愛玉 劉璇 萬(wàn)欣

摘要：本文研究了嗜熱脂肪芽孢桿菌平板計(jì)數(shù)方法，通過(guò)培養(yǎng)基類型、平板培養(yǎng)基的使用量，培養(yǎng)時(shí)的溫濕度及時(shí)間的控制，使得嗜熱脂肪芽孢桿菌能夠在平板上形成可觀察的單菌落，利于進(jìn)行計(jì)數(shù)。

關(guān)鍵詞：嗜熱脂肪芽孢桿菌；培養(yǎng)基；平板計(jì)數(shù)

嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermo—philus）屬嗜熱性需氧芽孢桿菌，但兼有厭氧的特性。該菌株運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)，培養(yǎng)溫度高，在平板上生長(zhǎng)擴(kuò)散快，很難形成單菌落[1]。

購(gòu)買來(lái)的生物指示劑，要對(duì)其芽孢量進(jìn)行測(cè)定，以判斷是否符合滅菌程序的驗(yàn)證要求。為此對(duì)利于嗜熱脂肪芽孢桿菌平板計(jì)數(shù)的培養(yǎng)方法進(jìn)行了研究，以方便進(jìn)行生物指示劑的孢子量確認(rèn)。

一、材料和方法

（一）菌種

嗜熱脂肪芽孢桿菌ATCC7953（壓力蒸汽滅菌生物指示劑，D121值1.3-1.9），孢子量F0≥8（103/只）。

（二）培養(yǎng)基

1.營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉3.0，氯化鈉5.0，瓊脂14.0，pH值7.2±0.2（25'E）。121℃高壓滅菌15分鐘備用。

2.胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（g/L）：胰酪胨15.0，大豆木瓜蛋白酶消化物5.0，氯化鈉5.0，瓊脂15.0，pH值7.3±0.2（25℃）。121℃高壓滅菌15分鐘備用。

3.溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，葡萄糖5.0，溴甲酚紫0.012，pH值7.0-7.2（25℃）。115℃高壓滅菌30分鐘備用。

（三）方法

將孢子量為103/只的嗜熱脂肪芽孢桿菌ATCC7953（壓力蒸汽滅菌生物指示劑）用0.9%氯化鈉溶液十倍稀釋法稀釋[2]，取O.1ml適當(dāng)稀釋度的菌懸液涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于不同條件下培養(yǎng)。

二、結(jié)果

（一）培養(yǎng)基類型

嗜熱脂肪芽孢桿菌對(duì)培養(yǎng)基的要求較低，本實(shí)驗(yàn)室所使用計(jì)數(shù)培養(yǎng)基通常為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，考慮到嗜熱脂肪芽孢桿菌的特殊性，經(jīng)查閱資料，將溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基加入選擇當(dāng)中。

在其它培養(yǎng)條件相同的情況下針對(duì)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基三種培養(yǎng)基進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基及胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基在培養(yǎng)溫度較高時(shí)培養(yǎng)基凝固效果不理想，較難形成肉眼可識(shí)別的單菌落無(wú)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。嗜熱脂肪芽孢桿菌在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨瓊脂上生長(zhǎng)良好，單菌落明顯且呈米黃色，與培養(yǎng)基的紫色形成對(duì)比，有利于計(jì)數(shù)。

（二）平板培養(yǎng)基的量

通常制備平板培養(yǎng)基所需的培養(yǎng)基的量為15-20ml，但由于嗜熱脂肪芽孢桿菌的培養(yǎng)溫度較高，水分蒸發(fā)較快，如果培養(yǎng)基的量較少，平板培養(yǎng)基易干裂。培養(yǎng)基的量確定為25ml。

（三）培養(yǎng)濕度控制的選擇

培養(yǎng)基在高溫下培養(yǎng)，若培養(yǎng)濕度過(guò)大，菌落擴(kuò)散很快，會(huì)分布整個(gè)平板，很難形成單菌落。但濕度太小，平板易于裂。

針對(duì)濕度過(guò)大處理方案為33℃預(yù)培養(yǎng)2天，蒸發(fā)平板表面水分后使用。針對(duì)防止培養(yǎng)濕度過(guò)小處理方案為培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)箱中放置裝有100ml純化水，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱內(nèi)濕度，防止平板干裂。

（四）培養(yǎng)溫度

嗜熱脂肪芽孢桿菌最低生長(zhǎng)溫度為28℃，最高生長(zhǎng)溫度70～77℃，最適生長(zhǎng)繁殖溫度為56～65℃。55℃培養(yǎng)24小時(shí)后可形成單菌落，但菌落過(guò)小，65℃培養(yǎng)24小時(shí)后菌落成片生長(zhǎng)，均不利于計(jì)數(shù)。而60℃培養(yǎng)24小時(shí)后形成的單菌落大小合適，利于肉眼計(jì)數(shù)且未成片生長(zhǎng)。

（五）培養(yǎng)時(shí)間

60℃培養(yǎng)18小時(shí)后形成較小的單菌落，肉眼計(jì)數(shù)較困難。培養(yǎng)24小時(shí)后形成的單菌落大小合適，利于肉眼計(jì)數(shù)。培養(yǎng)32小時(shí)后菌落成片生長(zhǎng)不利于計(jì)數(shù)。

三、討論

嗜熱脂肪芽孢桿菌由于培養(yǎng)時(shí)需要的溫度較高，導(dǎo)致水分蒸發(fā)較快，因此要注意培養(yǎng)時(shí)的溫濕度控制，并通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基的類型及平板的厚度使得其能在合適的培養(yǎng)時(shí)間得到肉眼可見且不擴(kuò)散的單菌落，從而達(dá)到利于計(jì)數(shù)的目的。

參考文獻(xiàn)：

[1]任香蕓，陳濟(jì)琛，蔡海松，林新堅(jiān)，邱宏端.嗜熱脂肪土芽孢桿菌CHB1生長(zhǎng)特性與培養(yǎng)條件研究[J].生物技術(shù)，2007（02）.

[2]李華.平板菌落計(jì)數(shù)的改進(jìn)方法[J].生物學(xué)通報(bào)，2006（01）.