李揚(yáng)

【摘要】目的：通過使用三氧化二砷（As2O3）誘導(dǎo)雌激素受體（estrogen receptor，ER）的再次表達(dá)，通過對乳腺癌細(xì)胞生長曲線的研究來探討ER在陰性乳腺發(fā)展過程中的作用。方法：本研究以ER陰性的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231為研究對象，采用免疫組化、生長曲線檢測法等生物學(xué)方法來檢測ER在陰性乳腺癌發(fā)展過程中的作用。結(jié)果：以MCF-7作為陽性對照，免疫組化結(jié)果顯示，As2O3可以誘導(dǎo)ER的再次產(chǎn)生。進(jìn)一步觀測MDA-MB-231細(xì)胞的生長曲線，發(fā)現(xiàn)ER可明顯抑制其生長，與對照組相比，有顯著性差異（P<0.05）。結(jié)論：ER的再表達(dá)可抑制陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的生長。

【關(guān)鍵詞】乳腺癌；雌激素受體（ER）；腫瘤生長

乳腺癌（breast cancer）是女性人群中常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害著女性健康。在中國，乳腺癌已經(jīng)占到了各種惡性腫瘤的10%左右，而且隨著生活環(huán)境的改變，發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢[1]。越來越多的研究證實(shí)，雌激素在女性乳腺癌發(fā)展過程中有關(guān)鍵性作用，顯示乳腺癌的發(fā)展具有雌激素依賴性。雌激素主要通過雌激素受體（ER）發(fā)揮作用，與乳腺癌的生長密切相關(guān)，ER的表達(dá)量過低可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，甚至抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡[2]。其可作為評估乳腺癌治療的激素依賴性和預(yù)測內(nèi)分泌治療效果的分子標(biāo)志物。

目前臨床上，對于ER陽性的乳腺癌患者多采用抗雌激素、雌激素撤除等辦法來進(jìn)行內(nèi)分泌治療。但有研究報(bào)道，目前還有1/3的乳腺癌患者屬于ER陰性，這些患者對內(nèi)分泌治療不敏感，而且預(yù)后差。因此如何使ER陰性的乳腺癌細(xì)胞再次表達(dá)ER以及其表達(dá)后對乳腺癌發(fā)展的影響研究便對臨床有著重要的意義。

本研究以ER陰性的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231為研究對象，使用國內(nèi)最早報(bào)道用于誘導(dǎo)治療的化學(xué)物質(zhì)AS203誘導(dǎo)ER的再次表達(dá)，通過對乳腺癌細(xì)胞生長曲線的研究來探討ER在其發(fā)生、發(fā)展過程中的意義，以期為ER陰性乳腺癌患者的治療提供一條新的思路。材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株：ER陰性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購買于上海細(xì)胞庫；ER陽性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購買于山東大學(xué)保藏中心。

主要試劑：三氧化二砷（AS203）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

雌激素受體（ER）陽性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，常規(guī)培養(yǎng)；雌激素受體（ER）陰性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231常規(guī)培養(yǎng)，將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×105/mL，換含AS203的培養(yǎng)液，至AS2O3終濃度分別為5.0μmol/L，連續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

免疫組化：（1）細(xì)胞爬片。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液，加入到預(yù)先已經(jīng)放置蓋玻片的24孔板中，每孔加入預(yù)先計(jì)算的細(xì)胞懸液量，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，取出蓋玻片，PBS洗干凈，風(fēng)干。冷丙酮固定10min.（2）加入3%HZOZ適量，37℃，30min，以用來清除內(nèi)源性過氧化物酶的影響；洗干凈；山羊血清封閉；加入ER抗體，過夜；洗干凈，加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃，30min，洗干凈；DAB顯色，顯微鏡下觀察；自來熟洗滌，蘇木素染色，沖洗反藍(lán)；酒精脫水，二甲苯透明，封片。用PBS代替一抗制成陰性對照。MCF-7作為陽性對照。

Westem Blot實(shí)驗(yàn)：（1）提取細(xì)胞的總蛋白。收集經(jīng)過不同處理的盡量多的細(xì)胞，預(yù)冷的1×PBS洗3次，800g，離心5min/每次。棄上清，加入細(xì)胞裂解液適量，置于冰上裂解10min，每隔2min吹打一次，800g，離心5min。（2）吸取上清利用己準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度并進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)。

生長曲線實(shí)驗(yàn)：將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，換含As2O3的培養(yǎng)液，至As2O3終濃度分別為5.0μmol/L，連續(xù)培養(yǎng)48h。采用電子監(jiān)控技術(shù)監(jiān)測其生長變化。

1.3 判定結(jié)果染色為陽性的細(xì)胞為

細(xì)胞或者細(xì)胞漿會(huì)出現(xiàn)黃棕色顆粒。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPASS統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細(xì)胞陰性檢測

與陽性對照MCF-7相比，MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞AS2O3處理前免疫組化結(jié)果顯示為陰性，染色部位主要為胞漿少量表達(dá)，顏色較淺；在As2O3處理后，主要表達(dá)在細(xì)胞核和胞漿，顏色較深，說明ER重造成功，結(jié)果如圖1所示。

2.2 MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞ER的蛋白表達(dá)情況

Westem Blot結(jié)果如圖2所示，ER呈陰性的MDA-MB-231細(xì)胞株，ER不表達(dá)，而經(jīng)As2O3處理后，MDA-MB-231細(xì)胞株ER表達(dá)，但與陽性細(xì)胞株MCF-7相比較，其表達(dá)量較低。

2.3 ER對MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株生長曲線的影響。

實(shí)驗(yàn)分為兩組（contrl組，即未經(jīng)As2O3處理；實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)As2O3處理），采用電子檢測探究ER對MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株生長曲線的影響。結(jié)果如圖3所示，處理后細(xì)胞生長曲線變得平緩，細(xì)胞生長受到抑制，提示我們或許ER抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的生長。

3 討論

ER蛋白是否表達(dá)是乳腺癌臨床激素治療的一個(gè)腫瘤標(biāo)記物。在臨床中，對于ER陽性乳腺癌會(huì)采用抗雌激素的手段來進(jìn)行治療。但還有約1/3的乳腺癌患者在初次診斷時(shí)，ER表達(dá)呈現(xiàn)陰性而無法得到治療，因此是否可以將這些患者由ER陰性轉(zhuǎn)化為陽性進(jìn)而使用內(nèi)分泌療法進(jìn)行治療。

Baj等[3]，報(bào)道砷劑對乳腺癌細(xì)胞株有誘尋凋亡的作用。Karasulu等[4]報(bào)道低濃度As2O3對正常機(jī)體細(xì)胞影響很小，但可以引起乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的凋亡。Chow等[5]實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，As2O3可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的生長。同時(shí)具有下調(diào)腫瘤細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)以及上調(diào)p53基因表達(dá)的作用。魏玲等[b]通過實(shí)驗(yàn)得出As2O3在體外可顯著抑制乳腺癌胞株MDA-MB-231細(xì)胞生長并引起凋亡，其機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞周期有關(guān)。As2O3誘導(dǎo)ER再次表達(dá)已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道。

本研究中采用As2O3對ER陰性的人乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行處理，使之重新表達(dá)ER。從免疫組化和WB結(jié)果可以看出，As2O3確實(shí)可以誘導(dǎo)ER的再次表達(dá)，但對于其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。已經(jīng)有研究報(bào)道，這可能與ER基因CpG島異常甲基化有關(guān)[7-9]。總結(jié)目前的研究其機(jī)制可能有：（1）ER基因的啟動(dòng)子區(qū)域高度的甲基化，使得相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄因子不能結(jié)合到該區(qū)域；（2）高度甲基化的啟動(dòng)子區(qū)域與組蛋白乙酞化狀態(tài)有關(guān)，染色體結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致其不易被轉(zhuǎn)錄[10，11]。生長曲線結(jié)果提示我們ER可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，這或許可以為臨床治療ER陰性患者提供一定的思路。

目前我們正在進(jìn)行更進(jìn)一步的研究，來進(jìn)一步探究As2O3誘導(dǎo)ER再次表達(dá)的機(jī)制以及其對內(nèi)分泌治療的反應(yīng)性。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)As2O3可誘導(dǎo)MDA-MB-231乳腺癌表達(dá)ERα，并且這種表達(dá)是有效表達(dá)，能夠使MDA-MB-231細(xì)胞系ERα基因中CpG島發(fā)生去甲基化。之后使用他莫昔芬（TAM）進(jìn)行治療時(shí)，細(xì)胞增殖受到明顯限制[12]。這也提示我們陰性乳腺癌患者不表達(dá)ER可能是因?yàn)榛驆u的異常甲基化有關(guān)，可能與基因突變、缺失等無關(guān)，這或許為ER陰性乳腺癌患者的治療提供了一條新的思路。我們將進(jìn)一步將實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展到體內(nèi)，采用動(dòng)物試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)進(jìn)一步研究，以期為臨床治療ER陰性的乳腺癌患者提供福音，為醫(yī)護(hù)人員提供一定的理論支撐。

參考文獻(xiàn)

[1]Zheng G，Peng F，Ding R，etal.Identification ofproteins responsible for themultiple drug resistance in5-fluorouracilinduced breastcancer cell using proteomicsanalysis[J].Cancer Res ClinOncol，2010，136：1477-1488.

[2]王海霞，解其貴，趙俊紅等.子宮內(nèi)膜癌雌激素受體α、β和孕激素受體mRNA與臨床病理的關(guān)系[J].中國臨床醫(yī)學(xué)，2008，15（06）：863-865.