李 鑫，楊 鉆，潘韜文，王嘉一，丁 雪，李 坤*

(1.遼寧師范大學化學化工學院，遼寧 大連 116029;2.大連醫(yī)科大學中西醫(yī)結合學院，遼寧 大連 116044)

濕熱痹膠囊是中國傳統(tǒng)中藥復方，由蒼術、忍冬藤、地龍、連翹、關黃柏、薏苡仁、防風、威靈仙、防己、川牛膝、粉萆薢、桑枝12味藥材組成，長期以來一直用于類風濕關節(jié)炎的治療。這些草藥都具有強大的抗炎活性[1-12]，并且在中國已經(jīng)有很好的治療風濕病和關節(jié)炎歷史[13]。中藥復方是通過眾多的化學成分相互協(xié)調(diào)作用以發(fā)揮藥效，確定其中化學成分展開全面研究是十分必要的。因此通過超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)確定濕熱痹膠囊中主要化學成分以及濕熱痹膠囊在動物體藥物原形成分，為尋找其中的活性化學物質(zhì)提供基礎，同時為濕熱痹膠囊在中醫(yī)臨床實踐中治療類風濕關性節(jié)炎奠定科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

SPF級SD大鼠，雄性，體重(200±20)g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗所使用動物嚴格按照實驗室動物保護指導原則進行，所使用動物征得大連醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會同意。

濕熱痹膠囊提取膏(本溪國藥中成藥工程技術研究中心有限公司)，羧甲基纖維素鈉(天津市大茂化學試劑廠)，肝素鈉(大連美倫生物技術有限公司)，色譜純甲醇(瑞典Oceanpak公司)，色譜純乙腈(瑞典Oceanpak公司)，超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)，Agilent 6530 四極桿飛行時間液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(美國安捷倫科技有限公司)，UGC-12W氮吹儀(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司)，大鼠代謝籠(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)

1.2 給藥設計

濕熱痹膠囊提取膏成人推薦用法用量：口服，一次4粒，一日3次。根據(jù)人和動物間按體表面積折算，換算為大鼠劑量:等劑量比值×(藥量/人的體重),其中成人標準體重設置為70 kg。

根據(jù)推薦劑量，設定本試驗的臨床劑量為正常給藥的劑量，換算為大鼠給藥劑量：濕熱痹膠囊提取膏，臨床劑量0.71 g/kg。

1.3 實驗方法

1.3.1生物樣品的收集

將SD大鼠隨機分為兩組(n=3)，即空白組和給藥組?？瞻捉M給予等劑量的生理鹽水，給藥組按0.71 g/kg劑量給大鼠灌胃，所有大鼠分別安置在代謝籠中用于收集尿液和糞便。在給藥后12 h，收集每只大鼠的尿液和糞便。尿液和糞便樣品保存在-80 ℃。所有大鼠再次分別灌胃給予生理鹽水和濕熱痹膠囊，并于在給藥后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h眼眶靜脈叢取血(約800 μL)于預先涂有1%肝素鈉生理鹽水的Eppendorf 管中，立即將血液樣品以4000 r/min(4 ℃)離心10 min以獲得血漿樣品。血漿樣品保存在-80 ℃。

1.3.2濕熱痹膠囊供試品溶液制備

取濕熱痹膠囊樣品，研細，取0.5 g，精密稱定，于50 mL的定容瓶中，加入50 mL色譜純甲醇，密塞，然后將混合物在超聲處理(250 W，頻率100 kHz)30 min，然后以13 000 r/min下離心10 min，取上清液，將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。

1.3.3生物樣品供試品溶液制備

血漿樣品供試液的制備：冷凍血漿樣品在室溫解凍，渦旋30 s，然后將200 μL血漿和600 μL乙腈混合。將這些混合液渦旋3 min，靜置5 min，然后以13 000 r/min離心10 min以沉淀蛋白質(zhì)。取上清液600 μL于1.5 mL Eppendorf管，混合各時間點的上清液，最終用氮氣吹干。-80 ℃凍存直至分析。復溶：50 μL甲醇重構并超聲處理，然后以13 000 r/min離心10 min，將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。

尿液樣品供試液的制備：冷凍尿液樣品在室溫解凍，渦旋30 s，然后將500 μL尿液和500 μL乙腈混合。將這些混合液渦旋3 min，靜置5 min，然后以13 000 r/min離心10 min以沉淀蛋白質(zhì)。取上清液800 μL于1.5 mL Eppendorf管，用氮氣吹干。-80 ℃凍存直至分析。復溶：100 μL甲醇重構并超聲處理，然后以13 000 r/min離心10 min，將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。

糞便樣品供試液的制備：冷凍的糞便樣品在37 ℃干燥，然后粉碎并充分混合。將2 mL甲醇加入0.1 g糞便粉末中。在超聲波浴將糞便樣品提取30 min，然后13 000 r/min離心10 min，取上清液1200 μL于1.5 mL Eppendorf管，用氮氣吹干。-80 ℃凍存直至分析。復溶：200 μL甲醇復溶并超聲處理，然后以13 000 r/min離心10 min，將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。

1.4 樣品檢測

1.4.1色譜條件

色譜柱為Waters公司C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，柱溫40 ℃。流動相為0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液，流速0.4 mL/min，進樣量為10 μL，注射泵方式連續(xù)進樣。分析條件：采用梯度洗脫，0 min時0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(95∶5,V/V)，在4 min內(nèi)升到0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(80∶20,V/V)，并維持等度洗脫至8 min，于14 min時升到0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(10∶90,V/V)，并維持等度洗脫至17 min。

1.4.2質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離離子源，正、負離子模式檢測：干燥氣體(N2)流速10.0 L/min；干燥氣體溫度350 ℃；鞘氣流量12.0 L/min；鞘氣溫度400 ℃；噴霧器氣體壓力30 psig(1 psi=6894.76 Pa)；毛細管電壓4 kV；碎片電壓120 V；錐孔電壓65 V；光學相干斷層掃描射頻750 V；MS/MS實驗碰撞電壓10/30 eV；一級質(zhì)譜母離子掃描范圍m/z 100～1500，二級離子掃描范圍m/z 100～1500。

2 結 果

2.1 血漿中藥物成分

血漿成分分析存在著含量低、組分多、分離難、生物個體差異大的特點，質(zhì)譜法測定入血成分快速、微量、精確。通過UPLC-MS法對濕熱痹膠囊組的大鼠血漿樣品進行分析，并與空白組比較，發(fā)現(xiàn)濕熱痹膠囊中有7個化學成分能被吸收進入血液(見表1，圖1)。本實驗血漿樣品中，檢測到7種原型入血成分，可能為濕熱痹膠囊的藥效物質(zhì)。但由于血漿中化合物濃度較低，混合時間點取樣以及對代謝產(chǎn)物的研究有限，未確定是否有新的代謝產(chǎn)物出現(xiàn)。

2.2 尿樣中藥物成分

SD大鼠灌胃給予濕熱痹膠囊后其尿液樣品進行檢測，并比較給藥血樣、空白血樣、濕熱痹膠囊的提取液基峰離子圖，共檢測發(fā)現(xiàn)6個藥物成分(原型成分)，其成分見表2，圖2。

2.3 糞便中藥物成分

SD大鼠灌胃給予濕熱痹膠囊后其糞便樣品進行檢測，并比較給藥血樣、空白血樣、濕熱痹膠囊的提取液基峰離子圖中，共檢測發(fā)現(xiàn)11個藥物成分(原型成分)，其成分見表3，圖3。

3 討 論

采用UPLC-MS法在濕熱痹膠囊分析出114種成分。分析出濕熱痹膠囊中7種入血的原型成分；在尿液中分析出濕熱痹膠囊原型成分6種；糞便中分析出濕熱痹膠囊原型成分11種。推測其可能為濕熱痹膠囊發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎。為進一步探究其作用機制，應進一步對24種原型成分進行抗炎、抗病毒等體外活性測試，期望篩選出具有抗炎、抗病毒的活性單體。

濕熱痹膠囊是傳統(tǒng)復方中藥，在臨床中應用較為廣泛，祛風除濕、清熱消腫、通絡定痛。用于濕熱痹證，其癥狀為肌肉或關節(jié)紅腫熱痛，有沉重感，步履艱難,發(fā)熱,口渴不欲飲，小便黃淡。研究結果表明，UPLC-MS法可以快速、系統(tǒng)地對濕熱痹膠囊中化學成分進行定性分析。研究較為全面系統(tǒng)地闡明濕熱痹膠囊的化學成分組成、探究其藥效物質(zhì)基礎，為濕熱痹膠囊的質(zhì)量控制研究及臨床應用提供堅實的理論依據(jù)。通過UPLC-MS法分析生物樣品(血漿、尿液及糞便)中濕熱痹膠囊中原型成分，為尋找其中的活性化學成分提供物質(zhì)基礎，同時為濕熱痹膠囊在中醫(yī)臨床實踐中治療類風濕關性節(jié)炎提供科學依據(jù)。

表1血漿樣品中藥物成分

NoRT(min)FormulaCompoundMeasured,Mode,Error(ppm)MS2 Fragmentions10.96C4H6O4Succinic acid117.0189[M-H]-(4.02)100.928623.55C17H24O9Syringa vulgaris395.1315[M+Na]+(-0.62)107.9641;184.8831;283.7984;382.268734.39C16H22O9Sweroside403.1271[M+COOH]-(-0.75)154.8969;228.8376;290.6950;332.762745.97C16H18O6Cimifugin307.1176[M+H]+(0.12)118.6173;141.9530;227.0545;298.141456.59C14H12O4Tetrahydroxystilbe-ne(isomer)289.0729[M+COOH]-(-4.7)123.1822;154.9076;186.9998;251.001168.86C19H22O5Imperanene331.1533[M+H]+(-2.03)164.9180;204.8883;252.8219;314.1860713.05C18H30O2α-linolenic acid301.2147[M+Na]+(-4.22)273.1498;225.1413;173.0975;159.1117

表2尿液樣品中藥物成分

NoRT(min)FormulaCompoundMeasured,Mode,Error(ppm)MS2 Fragmentions12.38C16H24O10Loganic acid399.1261[M+Na]+(0.32)179.0289;203.0538;219.0624;237.070124.36C17H26O10Loganin435.1516[M+COOH]-(-2.04)274.8388;238.9982;217.997535.27C22H24O93-Methoxynobile-tin477.1402[M+COOH]-(0.23)164.9221;268.7968;350.8278;410.736545.44C23H26O11Calceolarioside A477.1383[M-H]-(3.81)154.9031;215.9946;311.0420;393.343655.72C37H40N2O6Fangchinoline609.2963[M+H]+(-0.48)192.1000;367.1628;546.2193;578.2543610.09C27H34O11Arctiin(isomer)552.2437[M+NH4]+(0.39)201.0811;277.1273;384.6462;480.3543579.2075[M+COOH]-(1.49)268.8031;394.7677;464.0126;545.8841

表3糞便樣品中藥物成分

NoRT(min)FormulaCompoundMeasured,Mode,Error(ppm)MS2 Fragmentions12.341C13H10O2Atractylodinol216.1[M+NH4]+(4.53)136.9224;177.9454;199.943822.408C6H6O35-Hydroxymethylfurfural127.0388[M+H]+(1.32)112.086832.601C16H18O9Chlorogenic acid353.0833[M-H]-(-1.27)179.0366;135.042242.988C26H32O12Phellodendroside554.2209[M+NH4]+(4.21)138.9018;246.7883;342.8087;474.200353.834C20H18O5Moracin H356.1494[M+NH4]+(-0.45)177.0799;192.1017;251.0683;285.107564.033C20H23NO4Isocorydine342.1698[M+H]+(0.59)137.0608;177.0783;192.0989;214.081775.409C21H25NO4Tetrahydropalmatine356.1857[M+H]+(-0.31)170.7499;220.0862;264.0776;291.624286.619C38H42N2O6Menisine(isomer)623.3121[M+H]+(-0.92)174.0901;381.1806;592.266796.636C38H42N2O7Fenfangjine A639.306[M+H]+(0.76)192.0987;318.1532;452.7926;567.29421010.117C19H21NO2Argentinine296.1645[M+H]+(0.18)136.0610;166.0666;194.8710;254.53811111.361C39H62O12Ophiopogonin C'723.4305[M+H]+(1.85)685.4343;556.2338;432.6841;373.1499