李 鑫，楊 鉆，潘韜文，王嘉一，丁 雪，李 坤*

(1.遼寧師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，遼寧 大連 116029;2.大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，遼寧 大連 116044)

濕熱痹膠囊是中國傳統(tǒng)中藥復(fù)方，由蒼術(shù)、忍冬藤、地龍、連翹、關(guān)黃柏、薏苡仁、防風(fēng)、威靈仙、防己、川牛膝、粉萆薢、桑枝12味藥材組成，長期以來一直用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療。這些草藥都具有強(qiáng)大的抗炎活性[1-12]，并且在中國已經(jīng)有很好的治療風(fēng)濕病和關(guān)節(jié)炎歷史[13]。中藥復(fù)方是通過眾多的化學(xué)成分相互協(xié)調(diào)作用以發(fā)揮藥效，確定其中化學(xué)成分展開全面研究是十分必要的。因此通過超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)確定濕熱痹膠囊中主要化學(xué)成分以及濕熱痹膠囊在動(dòng)物體藥物原形成分，為尋找其中的活性化學(xué)物質(zhì)提供基礎(chǔ)，同時(shí)為濕熱痹膠囊在中醫(yī)臨床實(shí)踐中治療類風(fēng)濕關(guān)性節(jié)炎奠定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

SPF級SD大鼠，雄性，體重(200±20)g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)所使用動(dòng)物嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物保護(hù)指導(dǎo)原則進(jìn)行，所使用動(dòng)物征得大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會同意。

濕熱痹膠囊提取膏(本溪國藥中成藥工程技術(shù)研究中心有限公司)，羧甲基纖維素鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，肝素鈉(大連美倫生物技術(shù)有限公司)，色譜純甲醇(瑞典Oceanpak公司)，色譜純乙腈(瑞典Oceanpak公司)，超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)，Agilent 6530 四極桿飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(美國安捷倫科技有限公司)，UGC-12W氮吹儀(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司)，大鼠代謝籠(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)

1.2 給藥設(shè)計(jì)

濕熱痹膠囊提取膏成人推薦用法用量：口服，一次4粒，一日3次。根據(jù)人和動(dòng)物間按體表面積折算，換算為大鼠劑量:等劑量比值×(藥量/人的體重),其中成人標(biāo)準(zhǔn)體重設(shè)置為70 kg。

根據(jù)推薦劑量，設(shè)定本試驗(yàn)的臨床劑量為正常給藥的劑量，換算為大鼠給藥劑量：濕熱痹膠囊提取膏，臨床劑量0.71 g/kg。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1生物樣品的收集

將SD大鼠隨機(jī)分為兩組(n=3)，即空白組和給藥組。空白組給予等劑量的生理鹽水，給藥組按0.71 g/kg劑量給大鼠灌胃，所有大鼠分別安置在代謝籠中用于收集尿液和糞便。在給藥后12 h，收集每只大鼠的尿液和糞便。尿液和糞便樣品保存在-80 ℃。所有大鼠再次分別灌胃給予生理鹽水和濕熱痹膠囊，并于在給藥后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h眼眶靜脈叢取血(約800 μL)于預(yù)先涂有1%肝素鈉生理鹽水的Eppendorf 管中，立即將血液樣品以4000 r/min(4 ℃)離心10 min以獲得血漿樣品。血漿樣品保存在-80 ℃。

1.3.2濕熱痹膠囊供試品溶液制備

取濕熱痹膠囊樣品，研細(xì)，取0.5 g，精密稱定，于50 mL的定容瓶中，加入50 mL色譜純甲醇，密塞，然后將混合物在超聲處理(250 W，頻率100 kHz)30 min，然后以13 000 r/min下離心10 min，取上清液，將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。

1.3.3生物樣品供試品溶液制備

血漿樣品供試液的制備：冷凍血漿樣品在室溫解凍，渦旋30 s，然后將200 μL血漿和600 μL乙腈混合。將這些混合液渦旋3 min，靜置5 min，然后以13 000 r/min離心10 min以沉淀蛋白質(zhì)。取上清液600 μL于1.5 mL Eppendorf管，混合各時(shí)間點(diǎn)的上清液，最終用氮?dú)獯蹈伞?80 ℃凍存直至分析。復(fù)溶：50 μL甲醇重構(gòu)并超聲處理，然后以13 000 r/min離心10 min，將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。

尿液樣品供試液的制備：冷凍尿液樣品在室溫解凍，渦旋30 s，然后將500 μL尿液和500 μL乙腈混合。將這些混合液渦旋3 min，靜置5 min，然后以13 000 r/min離心10 min以沉淀蛋白質(zhì)。取上清液800 μL于1.5 mL Eppendorf管，用氮?dú)獯蹈伞?80 ℃凍存直至分析。復(fù)溶：100 μL甲醇重構(gòu)并超聲處理，然后以13 000 r/min離心10 min，將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。

糞便樣品供試液的制備：冷凍的糞便樣品在37 ℃干燥，然后粉碎并充分混合。將2 mL甲醇加入0.1 g糞便粉末中。在超聲波浴將糞便樣品提取30 min，然后13 000 r/min離心10 min，取上清液1200 μL于1.5 mL Eppendorf管，用氮?dú)獯蹈伞?80 ℃凍存直至分析。復(fù)溶：200 μL甲醇復(fù)溶并超聲處理，然后以13 000 r/min離心10 min，將獲得上清液用于UPLC-MS樣品分析。

1.4 樣品檢測

1.4.1色譜條件

色譜柱為Waters公司C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，柱溫40 ℃。流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，注射泵方式連續(xù)進(jìn)樣。分析條件：采用梯度洗脫，0 min時(shí)0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(95∶5,V/V)，在4 min內(nèi)升到0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(80∶20,V/V)，并維持等度洗脫至8 min，于14 min時(shí)升到0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(10∶90,V/V)，并維持等度洗脫至17 min。

1.4.2質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離離子源，正、負(fù)離子模式檢測：干燥氣體(N2)流速10.0 L/min；干燥氣體溫度350 ℃；鞘氣流量12.0 L/min；鞘氣溫度400 ℃；噴霧器氣體壓力30 psig(1 psi=6894.76 Pa)；毛細(xì)管電壓4 kV；碎片電壓120 V；錐孔電壓65 V；光學(xué)相干斷層掃描射頻750 V；MS/MS實(shí)驗(yàn)碰撞電壓10/30 eV；一級質(zhì)譜母離子掃描范圍m/z 100～1500，二級離子掃描范圍m/z 100～1500。

2 結(jié) 果

2.1 血漿中藥物成分

血漿成分分析存在著含量低、組分多、分離難、生物個(gè)體差異大的特點(diǎn)，質(zhì)譜法測定入血成分快速、微量、精確。通過UPLC-MS法對濕熱痹膠囊組的大鼠血漿樣品進(jìn)行分析，并與空白組比較，發(fā)現(xiàn)濕熱痹膠囊中有7個(gè)化學(xué)成分能被吸收進(jìn)入血液(見表1，圖1)。本實(shí)驗(yàn)血漿樣品中，檢測到7種原型入血成分，可能為濕熱痹膠囊的藥效物質(zhì)。但由于血漿中化合物濃度較低，混合時(shí)間點(diǎn)取樣以及對代謝產(chǎn)物的研究有限，未確定是否有新的代謝產(chǎn)物出現(xiàn)。

2.2 尿樣中藥物成分

SD大鼠灌胃給予濕熱痹膠囊后其尿液樣品進(jìn)行檢測，并比較給藥血樣、空白血樣、濕熱痹膠囊的提取液基峰離子圖，共檢測發(fā)現(xiàn)6個(gè)藥物成分(原型成分)，其成分見表2，圖2。

2.3 糞便中藥物成分

SD大鼠灌胃給予濕熱痹膠囊后其糞便樣品進(jìn)行檢測，并比較給藥血樣、空白血樣、濕熱痹膠囊的提取液基峰離子圖中，共檢測發(fā)現(xiàn)11個(gè)藥物成分(原型成分)，其成分見表3，圖3。

3 討 論

采用UPLC-MS法在濕熱痹膠囊分析出114種成分。分析出濕熱痹膠囊中7種入血的原型成分；在尿液中分析出濕熱痹膠囊原型成分6種；糞便中分析出濕熱痹膠囊原型成分11種。推測其可能為濕熱痹膠囊發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，應(yīng)進(jìn)一步對24種原型成分進(jìn)行抗炎、抗病毒等體外活性測試，期望篩選出具有抗炎、抗病毒的活性單體。

濕熱痹膠囊是傳統(tǒng)復(fù)方中藥，在臨床中應(yīng)用較為廣泛，祛風(fēng)除濕、清熱消腫、通絡(luò)定痛。用于濕熱痹證，其癥狀為肌肉或關(guān)節(jié)紅腫熱痛，有沉重感，步履艱難,發(fā)熱,口渴不欲飲，小便黃淡。研究結(jié)果表明，UPLC-MS法可以快速、系統(tǒng)地對濕熱痹膠囊中化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。研究較為全面系統(tǒng)地闡明濕熱痹膠囊的化學(xué)成分組成、探究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為濕熱痹膠囊的質(zhì)量控制研究及臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。通過UPLC-MS法分析生物樣品(血漿、尿液及糞便)中濕熱痹膠囊中原型成分，為尋找其中的活性化學(xué)成分提供物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)為濕熱痹膠囊在中醫(yī)臨床實(shí)踐中治療類風(fēng)濕關(guān)性節(jié)炎提供科學(xué)依據(jù)。

表1血漿樣品中藥物成分

NoRT(min)FormulaCompoundMeasured,Mode,Error(ppm)MS2 Fragmentions10.96C4H6O4Succinic acid117.0189[M-H]-(4.02)100.928623.55C17H24O9Syringa vulgaris395.1315[M+Na]+(-0.62)107.9641;184.8831;283.7984;382.268734.39C16H22O9Sweroside403.1271[M+COOH]-(-0.75)154.8969;228.8376;290.6950;332.762745.97C16H18O6Cimifugin307.1176[M+H]+(0.12)118.6173;141.9530;227.0545;298.141456.59C14H12O4Tetrahydroxystilbe-ne(isomer)289.0729[M+COOH]-(-4.7)123.1822;154.9076;186.9998;251.001168.86C19H22O5Imperanene331.1533[M+H]+(-2.03)164.9180;204.8883;252.8219;314.1860713.05C18H30O2α-linolenic acid301.2147[M+Na]+(-4.22)273.1498;225.1413;173.0975;159.1117

表2尿液樣品中藥物成分

NoRT(min)FormulaCompoundMeasured,Mode,Error(ppm)MS2 Fragmentions12.38C16H24O10Loganic acid399.1261[M+Na]+(0.32)179.0289;203.0538;219.0624;237.070124.36C17H26O10Loganin435.1516[M+COOH]-(-2.04)274.8388;238.9982;217.997535.27C22H24O93-Methoxynobile-tin477.1402[M+COOH]-(0.23)164.9221;268.7968;350.8278;410.736545.44C23H26O11Calceolarioside A477.1383[M-H]-(3.81)154.9031;215.9946;311.0420;393.343655.72C37H40N2O6Fangchinoline609.2963[M+H]+(-0.48)192.1000;367.1628;546.2193;578.2543610.09C27H34O11Arctiin(isomer)552.2437[M+NH4]+(0.39)201.0811;277.1273;384.6462;480.3543579.2075[M+COOH]-(1.49)268.8031;394.7677;464.0126;545.8841

表3糞便樣品中藥物成分

NoRT(min)FormulaCompoundMeasured,Mode,Error(ppm)MS2 Fragmentions12.341C13H10O2Atractylodinol216.1[M+NH4]+(4.53)136.9224;177.9454;199.943822.408C6H6O35-Hydroxymethylfurfural127.0388[M+H]+(1.32)112.086832.601C16H18O9Chlorogenic acid353.0833[M-H]-(-1.27)179.0366;135.042242.988C26H32O12Phellodendroside554.2209[M+NH4]+(4.21)138.9018;246.7883;342.8087;474.200353.834C20H18O5Moracin H356.1494[M+NH4]+(-0.45)177.0799;192.1017;251.0683;285.107564.033C20H23NO4Isocorydine342.1698[M+H]+(0.59)137.0608;177.0783;192.0989;214.081775.409C21H25NO4Tetrahydropalmatine356.1857[M+H]+(-0.31)170.7499;220.0862;264.0776;291.624286.619C38H42N2O6Menisine(isomer)623.3121[M+H]+(-0.92)174.0901;381.1806;592.266796.636C38H42N2O7Fenfangjine A639.306[M+H]+(0.76)192.0987;318.1532;452.7926;567.29421010.117C19H21NO2Argentinine296.1645[M+H]+(0.18)136.0610;166.0666;194.8710;254.53811111.361C39H62O12Ophiopogonin C'723.4305[M+H]+(1.85)685.4343;556.2338;432.6841;373.1499