吳嫣爽，胡興琳，周曉囡，雷蕾（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱150081）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是臨床常見原發(fā)性腫瘤，也是第三大癌癥相關(guān)致死性疾病［1-2］。癌癥動(dòng)物模型在研究腫瘤病理生理學(xué)特征和藥物治療中扮演了重要角色。近年來,一些研究小組相繼報(bào)道了動(dòng)物HCC模型［3］，這些研究大多使用化學(xué)藥物破壞肝細(xì)胞功能，誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)展［4］。這些模型雖然有效地獲得了HCC動(dòng)物模型，但是較長的建模時(shí)間以及較高的致死率限制了這些模型的應(yīng)用。此外，這些 HCC動(dòng)物模型中腫瘤細(xì)胞來源于動(dòng)物自體細(xì)胞，與人類的肝癌細(xì)胞在生物學(xué)特性上還有一些區(qū)別，因此，人腫瘤細(xì)胞異種移植的動(dòng)物模型可能更適用于臨床應(yīng)用性研究。

現(xiàn)有的人腫瘤細(xì)胞異種移植模型大多是嚙齒類癌癥模型［5］，巴馬小型豬在解剖和生理上與人類相似，更適合作為理想的動(dòng)物模型用于人HCC的研究［6］。

Selek等［7］將人膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植到豬的頂葉，在給予免疫抑制劑的情況下，建立了低分化腦膠質(zhì)瘤豬模型。Rai等［8］將人肝癌細(xì)胞通過門靜脈植入免疫缺陷豬的肝臟內(nèi)，雖然移植后一周在豬外周血中檢測(cè)到人甲胎蛋白（alpha-feto protein，AFP）的表達(dá)，但最終未檢測(cè)到肝腫瘤細(xì)胞。本研究通過腹腔鏡原位移植人肝癌細(xì)胞，建立人HCC的豬模型，為HCC臨床藥物試驗(yàn)和豬肝臟內(nèi)細(xì)胞移植等研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 人肝癌細(xì)胞系HepG2-GFP-Puro的培養(yǎng)：含1%青鏈霉素、10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中。

1.2 巴馬小型豬肝損傷模型的建立：選取健康，月齡約為3個(gè)月，體重為16～25 kg的巴馬小型豬。術(shù)前12小時(shí)禁止喂食和飲水。術(shù)前稱重，經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射丙泊酚10 mg每千克體重誘導(dǎo)麻醉，用呼吸麻醉機(jī)吸入1.5%～2.0%的異氟烷維持麻醉。將巴馬小型豬固定在腹腔鏡操作手術(shù)臺(tái)上，在腹腔鏡引導(dǎo)下，對(duì)巴馬小型豬的肝左葉切除，切除完成后進(jìn)行結(jié)扎，取出切除的部分肝臟。術(shù)后微創(chuàng)縫合傷口給予碘酒消毒，同時(shí)注射素青霉素80 U，鏈霉素40 U，1次/天，共3天，7天后對(duì)手術(shù)縫合的傷口進(jìn)行拆線，每天檢測(cè)體溫和體重。

1.3 腹腔鏡下HepG2-GFP-Puro植入巴馬小型豬肝實(shí)質(zhì)中：注射細(xì)胞前，將培養(yǎng)的HepG2-GFPPuro細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，用PBS重懸后進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過腹腔鏡操作，將細(xì)胞沿距離肝臟的斷面2 cm左右注射入巴馬小型豬的肝實(shí)質(zhì)中，注射共約10個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)約5×107個(gè)細(xì)胞。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組：2.5～5.0月齡的15只雄性巴馬小型豬（體重為12.0～25.2 kg） 作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分組（表1）。G0組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝切除術(shù)后在距離斷面約2 cm的位置注射0.2 ml生理鹽水/位點(diǎn)，共注射10個(gè)位點(diǎn)，記為假手術(shù)組。G1和G2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總計(jì)移植5×108個(gè)細(xì)胞，G2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后飼喂免疫抑制劑〔甲潑尼龍1 mg /（kg·d）；他克莫司膠囊1 mg/ d，10天后，2 mg/ d；霉酚酸酯0.25 g/ d，2 周后 0.5 g/ d〕。

表1 實(shí)驗(yàn)分組

1.5 巴馬小型豬術(shù)后采血：術(shù)后按照1、3、5、7、9、11、13、15天和3、4、5周的時(shí)間順序采取豬的頸部靜脈血，收集血清。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA） 檢測(cè)豬外周血清中人AFP表達(dá)量：按照Uscn公司的ELISA試劑盒說明書操作。用酶標(biāo)儀在450 nm波長測(cè)量各孔的吸光度（A）值。根據(jù)濃度和A值繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各孔樣品的實(shí)際濃度。

1.7 血生化儀檢測(cè)血清肝功能酶的變化情況：對(duì)分離的血清進(jìn)行肝功能酶丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）的分析，同時(shí)抽取G0組靜脈血為對(duì)照。

1.8 肝臟組織學(xué)形態(tài)的觀察：觀察各組肝臟的外觀情況。每組樣本取自肝右葉，在4%的甲醛溶液中固定，石蠟包埋、制成組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色和免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)及分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算分析，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 巴馬小型豬ALT和AST檢測(cè)結(jié)果（圖1）：術(shù)后第1天ALT和AST的水平均有一定程度地升高，第3天開始回落，在術(shù)后第7天之后基本恢復(fù)到正常的水平，之后一直維持在正常水平。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝功指標(biāo)ALT和AST在術(shù)后第1天出現(xiàn)大幅升高的現(xiàn)象，說明實(shí)施肝部分切除術(shù)可以引起肝功急性損傷。

2.2 移植后人肝癌細(xì)胞在巴馬小型豬肝臟內(nèi)嵌合生長情況（圖2）：組織化學(xué)染色顯示，在G1、G2組豬肝臟組織中檢測(cè)到GFP陽性細(xì)胞，即為移植到肝實(shí)質(zhì)內(nèi)的HepG2-GFP細(xì)胞。這些GFP陽性的細(xì)胞在肝小葉內(nèi)定植，單個(gè)或者2 ～ 5個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞團(tuán)，與周圍豬肝細(xì)胞嵌合生長。

圖1 各組AST與ALT的水平

圖2 巴馬小型豬肝臟組織GFP免疫組化染色（放大倍數(shù)200×）

2.3 移植的人肝癌細(xì)胞在巴馬小型豬肝臟內(nèi)分泌AFP的水平（圖3）：移植術(shù)后2周檢測(cè)到G2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血中含有（39.54±20.30）μg/L人AFP蛋白，G1組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血中含有（13.77±7.52）μg/L人AFP蛋白。移植術(shù)后4周檢測(cè)到G2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血中減少至（29.21±21.48）μg/L人AFP蛋白，G1組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血中含有（4.32±2.62 ）μg/L人AFP蛋白。G2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血中人AFP蛋白的含量顯著高于G1組（P＜0.05）。

圖3 巴馬小型豬外周血中人AFP蛋白含量的分析

2.4 移植后巴馬小型豬肝臟組織形態(tài)（圖4）：HE染色顯示巴馬小型豬術(shù)前肝臟呈正常組織形態(tài)：肝細(xì)胞呈不規(guī)則或圓形，胞質(zhì)嗜酸性，細(xì)胞核嗜堿性位于細(xì)胞中央，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈條索狀分布（圖4a）。G0組巴馬小型豬術(shù)后肝臟呈正常組織形態(tài)（圖4b）。G2組巴馬小型豬術(shù)后肝臟組織形態(tài)正常，在肝血竇內(nèi)有少量淋巴細(xì)胞（圖4c）；而G1組巴馬小型豬術(shù)后肝組織形態(tài)發(fā)生改變，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤，肝小葉內(nèi)出現(xiàn)纖維化，部分肝細(xì)胞變性壞死（圖4d）。

圖4 巴馬小型豬肝臟組織學(xué)檢測(cè)（放大倍數(shù)200×）

3 討 論

異種移植模型有利于研究肝細(xì)胞癌的發(fā)展及治療手段，但與人類相比，嚙齒類動(dòng)物體型偏小，并不適用于外科手術(shù)［9］。由于豬的解剖學(xué)與生理學(xué)特性與人類極為相近，豬的模型被認(rèn)為是目前最理想的候選模型之一。通過圖像引導(dǎo)的微創(chuàng)介入技術(shù)可以建立更適合于模擬人體內(nèi)環(huán)境的大動(dòng)物模型［10］。在本研究中，我們通過移植人肝臟細(xì)胞建立了一種大動(dòng)物的肝細(xì)胞癌模型。

本實(shí)驗(yàn)采用巴馬小型豬肝部分切除術(shù)，切除巴馬小型豬的肝左葉，在斷端附近注射人的肝癌細(xì)胞。Zhang等［11］的研究表明巴馬小型豬肝部分切除術(shù)可以模擬人肝部分切除術(shù)建立物理性肝損傷模型。多個(gè)研究的結(jié)果表明物理性肝損傷能夠促進(jìn)移植的細(xì)胞存活、增殖。Paschkis等［12］在肝部分切除的大鼠中建立了異種移植肝癌模型。我們的研究結(jié)果也提示：巴馬小型豬肝部分切除術(shù)可能有利于人肝癌細(xì)胞移植物的存活。

先前的研究表明，細(xì)胞免疫在異種移植的排斥反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用［13］。免疫抑制劑不僅用于預(yù)防同種異體移植排斥反應(yīng)，也可應(yīng)用于豬到非人靈長類的異種移植模型中［14］。因此，聯(lián)合免疫抑制劑可以用來延長異種移植物的存活時(shí)間［15］。研究表明，他克莫司引起T細(xì)胞調(diào)亡，霉酚酸酯通過阻斷用于DNA合成所需的鳥嘌呤核苷酸從而抑制T和B淋巴細(xì)胞的增殖［16］。在本研究中，血清中AFP含量的下降可能與豬的免疫系統(tǒng)排斥了移植的腫瘤細(xì)胞有關(guān)，肝組織的組織形態(tài)證實(shí)了這一推測(cè)。在移植G1組中發(fā)現(xiàn)部分受體移植后存在嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤。移植后在G2組中幾乎未觀察到炎性細(xì)胞浸潤。GFP免疫組化顯示，在G2組的肝實(shí)質(zhì)中，HepG2細(xì)胞比例顯著高于G1組。G2組中的AFP水平顯著高于G1組。這些結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用免疫抑制劑可以延長移植的人肝癌細(xì)胞在豬肝中存活的時(shí)間。