史 聰， 蔡麗婷， 邵方洋， 鄭賽巍， 汪丙杰， 何 園

(1. 同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，上海 200072； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院黏膜病學(xué)教研室-上海牙修復(fù)與再生工程實(shí)驗(yàn)中心，上海 200072; 3. 同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物信息學(xué)科,上海 200092)

口腔疾病的發(fā)生發(fā)展均與微生物群落結(jié)構(gòu)失調(diào)有關(guān)。深入了解健康狀態(tài)下的口腔微生物群落特征，有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)疾病狀態(tài)下的微生物群落特征，利于疾病的早期診斷及療效監(jiān)測?？谇粌?nèi)的微生物群落有細(xì)菌、病毒、真菌、支原體、古細(xì)菌和原生生物等[1]，其中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，目前檢測到的大約有1000種。近年來，隨著高通量測序技術(shù)及宏基因組學(xué)發(fā)展迅速，使得人們對微生物的認(rèn)識(shí)有了全新的視角。本研究擬采用宏基因組學(xué)技術(shù)，分析健康人的唾液微生物群落結(jié)構(gòu)，為口腔疾病的預(yù)防及診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

37名符合納入標(biāo)準(zhǔn)的受檢者均為上海地區(qū)的常住漢族居民，其中男性20名，女性17名，見表1。所有受檢者均由兩名經(jīng)培訓(xùn)的口腔專業(yè)醫(yī)生依據(jù)1997年WHO口腔健康調(diào)查基本方法進(jìn)行臨床檢查。受檢者的納入標(biāo)準(zhǔn)為： DFT(decay-filled index, DFT)=0；CPI(community periodontal index, CPI)=0。排除標(biāo)準(zhǔn)為： 患有其他口腔疾病(如口腔黏膜病、唾液腺疾病等)；口腔內(nèi)有修復(fù)體；少于28顆牙齒；患有全身系統(tǒng)性疾病及腫瘤；近1個(gè)月內(nèi)使用抗生素或抗真菌藥物；吸煙；女性處于月經(jīng)期、妊娠期或哺乳期。所有受檢者均在取樣前簽署了知情同意書，并且該研究得到了同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理道德委員會(huì)的批準(zhǔn)。

表1 37名受檢者的樣本信息Tab.1 Characteristics of 37 individuals in this study

1.2 樣本采集

所有受檢者均在樣本收集前完成必要的口腔檢查及樣本信息登記表。取樣前囑受檢者禁食2h。受檢者清水漱口1min，采集1.5mL非刺激性唾液，封口后立即置于-20℃冰箱中保存，并且隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中長期保存。

1.3 唾液樣本總DNA提取，PCR擴(kuò)增及測序

口腔唾液總DNA采用QIAamp DNA micro試劑盒提取(凱杰企業(yè)管理有限公司)，提取方法參照試劑盒使用說明，隨后用分光光度計(jì)檢測提取物的質(zhì)量和濃度。隨后采用TRANS公司的TransStartFastpfu DNA Polymerase，20μL反應(yīng)體系對V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，并且應(yīng)用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后PCR產(chǎn)物。16 S rRNA的V3～V4可變區(qū)通用引物設(shè)計(jì)如下。上游引物為5′-CCTAYG-GGRBGCASCAG-3′；下游引物為5′-GGACTACNN-GGGTWTCTAAT-3′。最后，由Illumina HiSeq 2500測序平臺(tái)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序(上海凌恩生物科技有限公司，中國)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Trimmomatic和QIIME(version 1.8)對序列進(jìn)行處理和分析。本研究過濾掉了序列長度小于200bp的序列，并且采用USEARCH方法鑒別并過濾掉嵌合體序列。按照97%的相似度劃分操作分類單元(operational taxonomic units, OUTs)，并與Greengenes數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，通過RDP分類器對OUT進(jìn)行逐級分類。運(yùn)用QIIME計(jì)算稀釋曲線和多樣性指數(shù)，并應(yīng)用Unweighted UniFrac方法計(jì)算樣本差異矩陣距離，然后進(jìn)行主成分分析(PCoA)。定義一級核心菌屬，標(biāo)準(zhǔn)為： 在所有樣本中均有分布，且在樣本中相對豐度均值≥2%的菌屬[2]。并且應(yīng)用iTOL對主要菌屬(平均相對豐度>0.1%)構(gòu)建唾液菌叢系統(tǒng)發(fā)育樹。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 樣本信息及基因組DNA序列分析

本研究通過Illumina HiSeq測序平臺(tái)測序共獲得1329271條優(yōu)質(zhì)序列，每個(gè)樣本平均為(35926.24±4718.069)條。這些序列可歸為110個(gè)屬，12個(gè)門，90.78%的序列可以分類到72個(gè)已知屬，測序質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。根據(jù)observed_species數(shù)據(jù)，做出每個(gè)樣本的稀釋曲線，曲線均趨于平坦，說明本次實(shí)驗(yàn)測序深度達(dá)到要求，見圖1。

2.2 唾液微生物結(jié)構(gòu)

健康青年人的口腔唾液菌群科分類到12門。其中5個(gè)高豐度菌門(相對豐度>5%)占總序列數(shù)的97.54%，分別為： 厚壁菌門(Firmicutes，42.21%)、變形菌門(Proteobacteria，27.78%)、擬桿菌門(Bacter-oidetes，14.34%)、放線菌門(Actinobacteria，7.96%)、梭桿菌門(Fusobacteria，5.25%)。除了5個(gè)高豐度菌門以外，還有3個(gè)菌門在所有樣本中均有分布，分別為TM7、螺旋體門(Spirochaetes)、SR1。健康青年人口腔微生物分布相對集中，以上8個(gè)核心菌門在總序列中所占比例為99.69%，見圖2。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of the oral microbiota稀釋曲線可以反映物種多樣性，由圖可知observed-species數(shù)量隨著序列條數(shù)增加而增加，最后達(dá)到平臺(tái)期，說明本研究深度達(dá)到要求

圖2 唾液微生物門在樣本中的分布Fig.2 Phylum-level relative abundance健康組菌群可分類到12個(gè)門，97.54%的序列屬于5個(gè)高豐度菌門，占序列比例為99.69%的8個(gè)核心菌門在所有樣本中均有分布，說明健康青年人口腔微生物分布相對集中

健康青年人的口腔唾液微生物在屬水平的分布也相對集中，主要微生物(相對豐度>10%)為鏈球菌屬(25.90%)和奈瑟菌屬(13.05%)。根據(jù)對核心菌的定義共得到12個(gè)核心菌屬，占微生物總序列的79.71%。分別為： 鏈球菌屬(Streptococcus)、奈瑟菌屬(Neisseria)、嗜血菌屬(Haemophilus，7.62%)、普氏菌屬(Prevotella，6.58%)、羅氏菌屬(Rothia，4.53%)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas,4.02%)、Gemellaceaegen.、韋榮菌屬(Veillonella,3.41%)、顆粒鏈球菌屬(Granulicatella，3.09%)、梭桿菌屬(Fusobacterium,2.74%)、放線菌屬(Actinomyces,2.52%)、纖毛菌屬(Leptotrichia,2.46%)，見圖3。為了更清楚地表達(dá)唾液的微生物群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步對主要菌屬(平均相對豐度>0.1%)構(gòu)建唾液菌叢系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。

圖3 樣本中核心微生物Fig.3 The relative abundance of core microbiome in samples在屬水平，健康人的唾液微生物菌群結(jié)構(gòu)分布也比較集中，相對豐度>10%的有鏈球菌屬和奈瑟菌屬

2.3 唾液微生物多樣性分析

各樣本的序列覆蓋度均在99.7%以上，說明樣本的測序量達(dá)到要求，基本覆蓋所有微生物。且男性與女性比較中，Shannon多樣性指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明男性與女性之間α多樣性沒有差異，見圖5A。各樣本的主成分分析比較集中，且男性與女性在各自象限有交叉，說明男性與女性之間菌群結(jié)構(gòu)相似，見圖5B。

3 討 論

唾液菌群是機(jī)體內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，其結(jié)構(gòu)在健康狀態(tài)下保持相對穩(wěn)定及與宿主之間的穩(wěn)態(tài)是維持口腔健康必不可少的條件。然而，當(dāng)這種平衡被某些原因打破后，菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)將引發(fā)疾病的發(fā)生。目前發(fā)現(xiàn)與微生物有關(guān)的疾病包括齲病[3]、牙周炎[4]等。還有些口腔微生物甚至影響全身健康，如有學(xué)者發(fā)現(xiàn)鏈球菌(Streptococci)與糖尿病有關(guān)[5]，糖尿病嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[6]。只有對健康狀態(tài)下的口腔唾液菌群菌群結(jié)構(gòu)有明確的認(rèn)識(shí)，才能更好的發(fā)現(xiàn)疾病狀態(tài)下微生物菌落結(jié)構(gòu)的改變及這種改變的影響。

圖4 健康成年口腔唾液菌叢屬水平系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Circular phylogenetic tree of saliva from healthy adults at genus level選取屬水平菌平均相對豐度>0.1%者，共有47個(gè)屬；左側(cè)圖例為科水平，右側(cè)圖中內(nèi)圈不同顏色代表不同的科水平菌，同一科的屬用相同顏色表示，外帶顯示相對豐度

圖5 健康人唾液菌群多樣性分析Fig.5 Analysis of the diversity of salivary microbiota in male and female subjectsA： 健康的男性與女性唾液樣本的Shannon多樣性指數(shù)分析，可見男性與女性之間菌群多樣性無差異；B： 健康的男性和女性兩組唾液樣本的主坐標(biāo)分析,可見男性與女性之間菌群結(jié)構(gòu)沒有差異

正常情況下，整個(gè)口腔，包括牙齒與黏膜均浸潤在唾液中，可以說唾液構(gòu)成了口腔的外環(huán)境。研究[7]表明，唾液微生物組受唾液采集方法、儲(chǔ)存及DNA提取的影響很小。因此，唾液是研究口腔微生物群落的重要生物樣本[8]。

近年來，高通量測序技術(shù)以及宏基因組學(xué)的發(fā)展使得人們對人類微生物組研究領(lǐng)域發(fā)生了革命性的進(jìn)展，尤其是對腸道微生物的研究[9]。相對于以往基于細(xì)菌培養(yǎng)的方法而言，高通量測序技術(shù)使得許多不能等培養(yǎng)的微生物得以被檢測到。與人類口腔微生物鑒別芯片(human oral microbe identification microarray, HOMIM)相比，高通量測序技術(shù)可以檢測到大量的低豐度物種[10]，如SR1、Tenericutesspp.和Synergistetesspp.。本研究測序的序列覆蓋度在99.7%以上，平均每個(gè)樣本為(35926.24±4718.069)條序列，并且稀釋曲線達(dá)到平臺(tái)期，比以往的研究更深入地檢測了口腔微生物菌群。

Segata等[11]和其他HMP(Human Microbiome Project, HMP)成員在一項(xiàng)由美國國立衛(wèi)生研究院設(shè)立的人類微生物組計(jì)劃中，通過對V1～V3和V3～V5 16 S rRNA高變區(qū)進(jìn)行測序，探索了超過200個(gè)個(gè)體的18個(gè)身體部位(包括口腔唾液)。這一大型的隊(duì)列研究項(xiàng)目明確了超過95%的口腔唾液微生物是由5個(gè)主要門組成： 厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、梭桿菌門。在本研究中，健康人的唾液微生物組成與HMP的研究結(jié)果一致，說明本次測序結(jié)果是可靠的。

核心微生物組是指所有或者絕大多數(shù)樣本共有的微生物[12]。核心微生物代表了口腔微生物的組成及菌群結(jié)構(gòu)，一個(gè)健康的口腔微生物群應(yīng)該由一個(gè)健康的“核心微生物”主導(dǎo)。這些含量豐富的核心微生物將保持健康生態(tài)系統(tǒng)所必需的功能穩(wěn)定性和體內(nèi)平衡。目前來看，在屬水平定義核心微生物組比在門水平定義更加合理。因此，本研究定義了一級核心菌屬，標(biāo)準(zhǔn)為： 在所有樣本中均有分布，且在樣本中相對豐度均值≥2%的菌屬[2]。根據(jù)對核心菌的定義共得到12個(gè)核心菌屬： 鏈球菌屬、奈瑟菌屬、嗜血菌屬、普氏菌屬、羅氏菌屬、卟啉單胞菌屬、Gemellaceaegen.、韋榮菌屬、顆粒鏈球菌屬、梭桿菌屬、放線菌屬、纖毛菌屬。

鏈球菌屬、奈瑟菌屬、放線菌屬、韋榮菌屬、顆粒鏈球菌屬是與健康息息相關(guān)的，這個(gè)觀點(diǎn)在第十二屆歐洲牙周病研討會(huì)中被達(dá)成共識(shí)[13]。格登鏈球菌(S.gordonii)是口腔生物膜群落的重要組成成分，作為口腔共生菌，可以促進(jìn)生物膜的穩(wěn)態(tài)的形成[14]，并且可以增加上皮屏障功能，有利于維持健康組織上皮的完整性。血鏈球菌(S.sanguis)也是常見的口腔共生菌，其產(chǎn)生的過氧化氫和血鏈素被認(rèn)為可以拮抗牙周致病菌[15]。韋榮菌屬也是參與口腔生物膜形成的早期定植菌，可與鏈球菌屬共聚，促進(jìn)格登鏈球菌生物膜的形成[16]。放線菌屬可與血鏈球菌共聚，保護(hù)其免受氧化損傷[17]。并且韋榮菌屬、奈瑟菌屬、放線菌屬在許多研究中均被證實(shí)為健康人口腔中的優(yōu)勢菌[4,18]。

本研究在核心微生物中也發(fā)現(xiàn)大量常見的與人類疾病相關(guān)的微生物。其中，卟啉單胞菌屬屬于“紅色復(fù)合體”，與牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19]。還有證據(jù)表明，牙齦卟啉單胞菌可能是包括口腔癌、腸癌和胰腺癌在內(nèi)的消化道腫瘤發(fā)展的驅(qū)動(dòng)因素，口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)也與其高度相關(guān)[10]。F.nucleatum是梭桿菌屬中調(diào)查最廣泛的物種，研究[20]表明，F(xiàn).nucleatum可以在人類牙齒上形成典型的牙菌斑，與牙周病有關(guān)，并可引起人類頭頸部、胸部、肺部、肝臟和腹部的侵襲性感染。羅氏菌是在齲洞中發(fā)現(xiàn)的，且在磨牙齲洞中的檢測率很高，表明其與齲病相關(guān)[21]。纖毛菌屬可存在于人體口腔及生殖道黏膜，進(jìn)入血液循環(huán)，可引發(fā)嚴(yán)重的膿毒血癥。這些微生物在健康狀態(tài)下不具有致病性，但是在機(jī)體免疫功能降低或口腔菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)時(shí)引發(fā)疾病影響宿主的健康。因此，健康人口腔微生物的研究，可促進(jìn)對口腔微環(huán)境的了解，在疾病預(yù)防和早期診斷及治療中有重要意義。