賀 文， 吳婉婉， 陸 平， 薛志剛， 盛哲津， 祝獻民

(1. 同濟大學醫(yī)學院,上海 200092； 2. 同濟大學生命科學與技術學院,上海 200092)

成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復序列技術(clu-stered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)是近年來發(fā)展起來的一種高效的基因編輯工具，已經廣泛的應用在基因治療、基因功能研究、農作物品種改良、動物模型制作、靶向藥物篩選和材料生物學等領域[1]。它能夠快速、高效地對特異的基因組位點進行切割或置換，而且特異性高，細胞毒性低[2]。然而基于核酸內切酶的CRISPR基因編輯檢測存在靈敏度低，特異性差等問題[3]?；蛐丸b定分析是遺傳學和生物醫(yī)學領域最常見的分析手段，但高通量快速鑒定基因型仍然是亟待解決的問題[4]。綜上，快速和高效地檢測CRISPR基因編輯產物以及生物樣本的基因型具有非常重大的應用前景。高分辨率熔解曲線(high-resolution melting curve, HRM)分析是近年來發(fā)展起來的一種新型基因分析技術，通過區(qū)分不同核酸組成的熔解曲線差異，能夠鑒定基因組突變和單核苷酸多態(tài)性[5]。HRM技術具有高特異性、高靈敏性、高通量、低成本、速度快等優(yōu)點，因而在臨床診斷及基因分析上得到迅速的應用與發(fā)展，現(xiàn)已成為生命科學研究中的熱點技術[6-7]。每種DNA具有特定的熔解曲線[8]，因此HRM可以應用于CRISPR技術切割產物以及基因型的快速鑒定。然而目前HRM分析通常依賴PCR平臺匹配的收費軟件，由于版權和價格問題，不利于在實驗室推廣。

本研究將在線HRM分析軟件與PCR技術進行結合，提高了CRISPR技術體外切割產物驗證及不同基因型鑒定的效率。運用該方法準確驗證了CRISPR系統(tǒng)在非洲猴腎細胞COS7的視網膜色素上皮65(retinal pigment epithelium 65, RPE65)基因處的切割效率，以及對瘦素(leptin, Lep)突變的SD大鼠的3種子代基因型進行快速的鑒定，并且以CRISPR所產生的不同切割產物和不同基因型PCR擴增產物的熔解曲線為例，詳述了HRM分析軟件的使用方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 本研究使用非洲猴腎細胞COS7和斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley, SD)大鼠。COS7細胞體外轉染了gRNA和Cas9。鑒定基因型的SD大鼠為Lep敲除的雜合子大鼠(LepΔI14/-)的子代[9]，分別為野生型(WT)大鼠、雜合突變(LepΔI14/-)和純合突變(LepΔI14/ΔI14)大鼠。

1.1.2 主要試劑和儀器 細胞DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；鼠尾基因組DNA提取試劑盒購自美國Bimake公司；Taq DNA酶，DNA熒光染料EvaGreen購自上海翊圣生物科技有限公司；Q5酶購自美國NEB公司；PCR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；內參染料ROX購自大連寶生物工程有限公司；QuantStudio7 PCR儀購自美國美國應用生物系統(tǒng)公司；電泳儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 基因組DNA提取

使用細胞DNA提取試劑盒提取COS7細胞基因組；使用鼠尾基因組DNA提取試劑盒提取Lep敲除的雜合子大鼠子代基因組，均置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計

分別根據食蟹猴RPE65(AGTTTCTTGTAAC-CACCAGC)和大鼠Lep突變位點[9]的序列信息，使用在線引物設計軟件Primer3(http:∥primer3.ut.ee/)設計RPE65和Lep突變位點所對應的引物。

1.4 PCR擴增

為了富集突變位點序列，首先擴增300～600bp目的片段[10]。反應體系為20μL，包括10μL緩沖液，7μL水，1μL上游引物，1μL下游引物和1μL DNA。反應條件為： 94℃預變性5min，94℃變性20s，58℃退火30s，72℃延伸20s，共35個循環(huán)，最后72℃ 5min。用ddH2O將PCR產物稀釋10000倍，作為第2次PCR模板。第2步PCR產物長度范圍為45～150bp。反應體系為20μL，包括11μL水，4μL Q5緩沖液，0.4μL dNTP，1μL上游引物，1μL下游引物，0.2μL Q5酶，1μL 20× EvaGreen染料，0.4μL 50× Rox和1μL模板DNA。PCR反應條件為： 98℃預變性30s，98℃變性10s，60℃退火15s，72℃延伸10s，共50個循環(huán)，隨后繼續(xù)95℃加熱解鏈2min，25℃ 2min，最后4℃ 2min。

1.5 HRMA檢測

本次研究采用384孔，每孔轉入10μL PCR產物。在實時熒光定量PCR儀(QuantStudio7)的參數設置中，分別選擇“Melt curve”和“Sybr Green”，連續(xù)熒光的讀數間隔為0.05s。實驗結束，使用QuantStudioTMReal-Time PCR軟件獲得熔解曲線圖。

1.6 在線軟件HRM Analyzer數據分析

QuantStudio7所得溫度和熒光讀數等數據整理成.txt文件格式，將所得文件上傳至在線軟件HRM Analyzer(http:∥www.flyrnai.org/hrma)，得到標準化圖和聚類圖，最后進行HRM分析。

2 結 果

2.1 引物特異性檢測

本研究根據相應的基因組信息分別設計了針對食蟹猴RPE65基因和大鼠Lep基因的PCR引物，引物序列如表1所示。為了驗證PCR引物的特異性，本研究對PCR產物進行了瓊脂糖凝膠電泳。兩步PCR的產物條帶都非常均一，沒有雜帶。這說明所設計的引物能夠特異性識別模板，可用于HRM分析，見圖1。

表1 PCR引物Tab.1 The PCR primers

圖1 兩步PCR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR productsA： RPE65基因兩步PCR擴增條帶;1、2、3、4分別為陽性對照、陰性對照、MOI值為100和20的慢病毒轉染COS7細胞;1-1、2-1、3-1、4-1為重復實驗；B： Lep基因兩步PCR擴增條帶;1’、2’和3’分別為野生型、雜合突變(LepΔI14/-)大鼠和純合突變(LepΔI14/ΔI14)大鼠;1’-1、2’-1、3’-1為重復實驗

2.2 CRISPR基因編輯檢測

本研究利用慢病毒將CRISPR系統(tǒng)導入COS7細胞，對RPE65基因進行編輯。為了檢測基因編輯效率，共選取4種樣品，分別為未轉染COS7細胞(陰性對照)、RPE65基因已被CRISPR系統(tǒng)編輯的COS7細胞(陽性對照)，MOI值分別為100和20的慢病毒轉染的COS7細胞(實驗組)。細胞基因組提取之后置于QuantStudio7 PCR儀中得到熔解曲線。陽性對照與其他3個樣品有明顯區(qū)別，由此可以初步說明CRISPR系統(tǒng)在被轉染的細胞中發(fā)揮了編輯作用，見圖2A。為驗證這一結果，將數據整理并上傳至在線軟件HRM Analyzer進行分析。陽性對照和其他樣品可以區(qū)分開來，見圖2B、C；同時實驗組和陰性對照聚類，表明CRISPR系統(tǒng)在慢病毒感染的COS7細胞中并未編輯RPE65基因，該結果與T7EI檢測結果一致，見圖2D。與陽性對照相比，實驗組未出現(xiàn)3條帶，COS7細胞中RPE65基因沒有被編輯。

圖2 HRM和T7E1分析COS7細胞RPE65基因編輯結果Fig.2 HRM and T7E1 analyses of RPE65 gene editing in COS7 cellsA： QuantStudioTM Real-Time PCR軟件所得PCR產物熔解曲線，陽性對照為圖中黃色顯示曲線;B、C： HRM Analyzer所得標準化圖與聚類圖，陽性對照分別是圖B中位于上方和圖C中位于下方的曲線;D： T7酶切驗證結果，與陽性對照相比實驗組未出現(xiàn)三條帶

2.3 基因型鑒定

純合突變(LepΔI14/ΔI14)大鼠不育，繁殖Lep突變的大鼠需要雜合子[9]。為鑒定子代基因型，本研究使用HRM進行鑒定。同樣在PCR之后，將所得的數據傳至軟件QuantStudio Real-Time PCR Software，實驗結果顯示雜合突變大鼠與純合大鼠熔解曲線只有微小差別，見圖3A。為驗證這一實驗結果，將數據上傳至在線軟件HRM Analyzer進行分析驗證。雜合子對應曲線聚為一類，而純合子和野生型大鼠對應曲線聚為一類，見圖3B、C。HRM分析得到的結果與DNA測序結果一致。這說明HRM可將純合和雜合突變基因區(qū)分開，卻未能區(qū)分純合突變和野生型大鼠。

圖3 HRM與DNA測序分析Leptin雜合大鼠(LepΔI14/-)子代基因型結果Fig.3 Genotyping of LepΔI14/- rat progeny by HRM and DNA sequencing analysisA： QuantStudio Real-Time PCR軟件所得PCR產物熔解曲線，雜合子為左邊突出的曲線；B、C： HRMAnalyzer所得標準化圖和聚類圖，雜合子分別是圖B位于下方和圖C位于上方的曲線；D： DNA測序分析Lep突變大鼠3種子代基因型

3 討 論

HRM是近年來開發(fā)的用來基因分型和突變掃描的新型遺傳學分析方法，可以用來檢測目的片段基因組中的序列變化。DNA雙鏈結合飽和熒光染料進行變性升溫，然后利用熒光讀取DNA解鏈的過程中的特異熔解曲線而達到鑒定不同DNA的目的[11]。與傳統(tǒng)的PCR方法及常規(guī)的測序手段相比較，這種方法可在進行兩步普通的PCR反應中實現(xiàn)，無需電泳鑒定，具有快速、簡便、經濟、可重復、污染低等優(yōu)點。一旦PCR模板中基因組序列發(fā)生了改變，HRM分析軟件在標準化與聚類后就能準確檢測到相應的熔解曲線的變化。因此，這種方法比傳統(tǒng)的PCR和測序手段更為便捷和簡單，并且更為經濟和環(huán)保[12-13]。最近，Housden等[10]在果蠅中使用HRM檢測了CRISPR技術編輯后的產物，與此同時，將這項技術應用在CRISPR在細胞和哺乳動物水平的檢測，對HRM分析手段進行了拓展與延伸。

CRISPR技術的誕生為科學研究和人類疾病的治療提供了有力的手段和良好的平臺，同時也為精準醫(yī)療的實現(xiàn)提供了新的策略和方向[14]。但由于其基因編輯效率低，且存在較大的脫靶效應，因此，該種技術手段在基因編輯之后可能會存在多種作用產物。Xu等[9]的研究中對CRISPR-Cas9技術切割產物的驗證使用T7EI核酸內切酶進行驗證，和本文所闡述的HRM的方法相比較，T7EI核酸內切酶驗證的方法不靈敏，非特異性結合比較大，且產物采用電泳實驗后進行肉眼觀察，可能會引入人為的誤差，導致檢測結果產生偏差[15]。相比之下，HRM方法使用熒光染料進行檢測，靈敏度高，且產物均在原管中進行反應，不會引入外界污染而造成不必要的誤差；在兩步PCR反應結束后，只需10～20min進行熔解曲線的檢測，再通過在線HRM軟件分析，更為方便、經濟和快捷。

如上所述，HRM分析可以快速鑒定CRISPR編輯和區(qū)分基因型。然而在使用在線軟件分析HRM時，也發(fā)現(xiàn)了軟件本身的一些不足。例如： 生成標準化圖之前，每組數據之間的上下閾值需要多次手工調試才能生成理想的圖像。而且，這種方法不能定量的分析CRISPR的編輯效率；針對大鼠Lep基因時，不能區(qū)分純合的野生型與突變基因型。因此，HRM分析在實際應用中可以根據需要增加其他輔助方法，例如在基因型鑒定中可以對不能分型的純合子直接進行DNA測序，同樣能減少成本和時間，快速達到實驗目的。

本研究對CRISPR技術編輯的COS7細胞中RPE65基因進行驗證，通過使用在線軟件分析，發(fā)現(xiàn)經過基因編輯的RPE65基因的熔解曲線與陰性對照顯著不同。同樣，在Lep突變的雜合子大鼠的子代基因型中，發(fā)現(xiàn)HRM可以明顯區(qū)分雜合子和純合子。盡管HRM分析還存在某些不足，但是經過進一步的改良，HRM分析技術必將在CRISPR基因編輯檢測和基因型鑒定等研究領域展現(xiàn)更廣闊的應用前景。