張永福， 莫麗玲， 董翠蓮， 牛燕芬， 趙明方

(昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南昆明 650214)

煙草(NicotianatabacumL.)為茄科煙草屬一年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲，我國各地已引種栽培，現(xiàn)已成為我國重要的經(jīng)濟作物[1]。一般認為，煙草為“忌氯作物”，過量吸氯會嚴重影響烤煙的品質(zhì)，如葉片厚而脆、無彈性、香氣減少、品質(zhì)變劣、燃燒性下降等[2]。眾多研究表明，對缺氯的土地施用適量的含氯肥料能促進煙葉生長，增強細胞膨壓，提高抗旱能力和煙葉產(chǎn)量；同時適量的氯元素能增加煙草葉片的彈性和油潤性，降低煙葉破碎率，提高煙葉的內(nèi)、外品質(zhì)[3-8]。因此，氯是煙草必需的重要營養(yǎng)元素之一。

煙草是我國重要的經(jīng)濟作物和國民收入的重要來源。迄今，人們還普遍認為煙草是忌氯作物，在煙草生產(chǎn)中仍然不主張施用含氯肥料，而一直施用無氯化肥，有機肥施用相對不足。但實際上煙草為“氯敏感作物”，土壤氯元素?zé)o法得到及時補充而迅速下降，導(dǎo)致我國大多數(shù)煙區(qū)煙葉氯含量偏低，過低的煙葉含氯量逐漸成為影響煙葉質(zhì)量和工業(yè)利用價值的限制因子[6，9-11]。適量施用氯肥，能夠促進煙株健壯生長，增強煙株抗逆能力，改善煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，開展不同施氯量對煙草生長及生理影響的研究，對于如何在生產(chǎn)中控制含氯肥料的施用，確保煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的提高具有重要意義。

在實際生產(chǎn)中，常常遇到一些棘手的問題，就是煙草生長中施用哪種氯化物效果最好？不同氯化物對煙草生長及生理特性的影響是否相同？不同氯化物施用的最佳劑量是多少？若施用不當，則高濃度氯脅迫會破壞細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，細胞膜選擇性喪失，細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，使植物電導(dǎo)率和丙二醛含量升高，葉綠素降解，抗氧化酶活性增強，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加[12-13]。為了確定煙草上適宜施用哪種氯化物作為提供氯元素的肥料以及適宜施用的劑量，本研究以云南省普遍種植的煙草品種紅花大金元為試驗材料，研究NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2等不同價態(tài)和不同濃度的氯化物對煙草株高、莖粗、總生物量、根冠比、葉形態(tài)特征、根系活力、膜脂過氧化系統(tǒng)及有機營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響，以期揭示4種氯化物對煙草生長生理的影響機制，為煙草生產(chǎn)中施用含氯化合物補充氯元素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為云南省普遍種植的煙草品種紅花大金元，種子來源于云南省保山市煙草公司，在昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院實踐基地育苗，待苗長至高12 cm左右時移入22 cm×26 cm營養(yǎng)缽中種植，基質(zhì)為泥炭+蛭石+珍珠巖(體積比為2 ∶2 ∶1)，每缽種1株，每周澆2次Hoagland營養(yǎng)液，每次每缽澆500 mL。

1.2 試驗設(shè)計與實施

待煙草長至50 cm時挑選生長健壯、無病蟲害、生長整齊一致的植株分別用不同的氯化物進行處理，NaCl、KCl的濃度分別為50、100、150 mmol/L，CaCl2、MgCl2的濃度分別為25、50、75 mmol/L。隨機區(qū)組處理，每個處理10株，設(shè)置12個處理：T1為50 mmol/L NaCl，T2為100 mmol/L NaCl，T3為 150 mmol/L NaCl，T4為50 mmol/L KCl，T5為100 mmol/L KCl，T6為150 mmol/L KCl，T7為25 mmol/L CaCl2，T8為 50 mmol/L CaCl2，T9為75 mmol/L CaCl2，T10為25 mmol/L MgCl2，T11為50 mmol/L MgCl2，T12為75 mmol/L MgCl2，設(shè)1個對照(CK)。處理液每天澆1次，每次每株澆250 mL，至處理后15d時采樣測定各生理指標，至開花時測定植株形態(tài)指標。試驗重復(fù)4次。測定根系活力的材料為根尖；測定丙二醛含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性、氧自由基產(chǎn)生速率、過氧化氫含量的材料為新鮮、成熟、健康的葉肉組織；測定可溶性糖含量、淀粉含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、游離脯氨酸含量的材料為成熟、健康的葉片于95 ℃烘干磨碎后過100目標準篩的粉末。

1.3 指標測定與分析

用卷尺分別測定煙草的株高、葉片長度和葉片寬度；用游標卡尺測定煙草的莖直徑和葉片厚度；用電子天平(精密度0.001 g)稱取植株生物量；把整個植株清洗干凈后于95 ℃烘箱烘干，稱取地上部和地下部的質(zhì)量，根冠比 = (地上部干質(zhì)量/地下部干質(zhì)量)×100%；葉形指數(shù) = 葉片長/葉片寬。

根系活力采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)還原法測定；丙二醛含量采用雙組分光光度法測定；SOD活性采用氮藍四唑(NBT)光氧化法測定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚-H2O2顯色法測定；氧自由基產(chǎn)生速率采用羥胺法測定；過氧化氫含量采用硫酸鈦-濃氨水顯色法測定；可溶性糖含量采用硫酸-苯酚法測定；淀粉含量采用碘-碘化鉀顯色法測定；可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍G250法測定；游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法測定[14]。所有指標均測定3次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行Duncan氏差異顯著性分析，采用Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種氯化物對煙草植株形態(tài)特征的影響

從表1可以看出，4種氯化物處理對煙草株高、莖直徑、總生物量和根冠比的影響較大。T1處理的株高最高，分別比T3、T7、T8、T9處理高30.57%、27.23%、30.57%、30.85%，T1處理與這4個處理間差異顯著。莖直徑最大的為T7處理，顯著大于除T10和CK外的各處理；T1、T2、T4、T5、T6處理則顯著小于其他處理，與CK相比分別低48.83%、52.05%、50.68%、51.61%、50.91%；此外，T11處理的莖直徑也顯著小于CK。T2和CK處理的總生物量顯著高于其他處理，而T1、T3、T4、T5、T6、T8、T9、T12處理則顯著低于其他處理，分別比CK低41.72%、39.25%、39.73%、39.88%、43.60%、42.23%、45.55%、43.04%。T9處理的根冠比顯著高于其他各處理，比CK高118.03%；T1、T2、T3、T6、T7、T12處理也顯著高于CK，而T4處理則比CK低 27.70%，處理間差異顯著。

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)。表2同。

2.2 4種氯化物對煙草葉片形態(tài)特征的影響

從表2可以看出，4種氯化物處理對煙草葉片數(shù)、葉片厚、葉長、葉寬和葉形指數(shù)均產(chǎn)生一定影響。除T5處理的葉片數(shù)顯著低于其他處理外，其他不同處理間差異不顯著；與CK比較，T5處理葉片數(shù)減少了40.22%。T1處理的葉厚顯著大于T4、T6、T7、T12處理，而T6處理顯著小于其他處理，比CK低44.00%。T8處理的葉長顯著短于除T3、T9處理外的各處理，比CK短13.45%，其他處理間差異不顯著。T2、T6、T7、T9、T10、T11、T12處理的葉寬顯著高于T4、T8處理；T4、T8處理的葉寬分別比CK低10.51%、11.21%。T4、T5處理的葉形指數(shù)顯著大于T2、T7、T9、T11處理，T4、T5處理的葉形指數(shù)分別比CK高9.72%、5.56%。

2.3 4種氯化物對煙草根系活力和葉片丙二醛含量的影響

4種氯化物處理對煙草的根系活力和葉片丙二醛含量造成較大影響。與CK相比，T1、T2、T3、T4、T8、T9、T10、T11處理的根系活力均下降，分別降低了36.77%、30.83%、35.15%、46.38%、53.66%、62.23%、56.85%、56.68%；T5、T7處理分別比CK上升了40.68%、42.81%，處理間差異顯著(圖1-A)。T2、T3、T4、T7、T8、T9處理的丙二醛含量分別比CK高186.98%、204.73%、160.35%、126.63%、181.06%、118.93%，且差異顯著，其他處理與CK間差異不顯著(圖1-B)。

2.4 4種氯化物對煙草超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性的影響

4種氯化物處理對煙草葉片SOD活性影響較大，而對POD活性的影響相對較小。T4、T5處理的SOD活性顯著高于其他處理，分別比CK高223.88%、225.42%；T1、T2、T9、T12處理的POD活性也顯著高于CK，分別比CK高153.82%、132.51%、133.02%、96.46%；T3處理的POD活性則比CK低48.37%， 處理間差異顯著(圖2-A)。T10處理的 POD活性顯著高于其他處理，比CK高39.38%，T11處理比CK高20.67%，處理間差異顯著性；T1處理則顯著低于CK，比CK低43.30%，其他處理與CK的差異不顯著(圖2-B)。

表2 4種氯化物對煙草葉片形態(tài)特征的影響

2.5 4種氯化物對煙草氧自由基產(chǎn)生速率和過氧化氫含量的影響

4種氯化物處理使煙草葉片氧自由基產(chǎn)生速率和過氧化氫含量有不同程度的上升。除T1、T4處理外，其他處理的氧自由基產(chǎn)生速率均顯著高于CK，T2、T3、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12處理分別比CK高22.52%、36.97%、32.60%、33.59%、24.47%、18.91%、22.05%、22.46%、27.18%、41.30%(圖3-A)。不同處理的過氧化氫含量顯著高于CK，T1至T12處理分別比CK高51.90%、77.10%、75.14%、49.33%、66.75%、66.52%、32.40%、31.35%、24.91%、54.36%、40.87%、60.92%(圖3-B)。

2.6 4種氯化物對煙草可溶性糖和淀粉含量的影響

4種氯化物處理對煙草葉片可溶性糖和淀粉含量影響較大。T6、T8處理的可溶性糖含量分別比CK高44.83%、32.02%，處理間差異顯著；T1、T3、T5、T12處理則分別比CK低26.60%、22.66%、29.06%、21.18%，處理間差異顯著(圖4-A)。T10處理的淀粉含量顯著高于其他處理，比CK高76.85%，處理間差異顯著；T8、T11、T12處理分別比CK高14.78%、31.24%、37.80%，處理間差異顯著；T1處理則顯著低于CK，比CK低40.45%(圖4-B)。

2.7 4種氯化物對煙草可溶性蛋白質(zhì)和游離脯氨酸含量的影響

4種氯化物處理對煙草葉片可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量產(chǎn)生的影響較大。T11、T12處理可溶性蛋白質(zhì)含量顯著低于CK，分別比CK低30.34%、20.34%，其他處理與CK差異不顯著(圖5-A)。T1、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12處理游離脯氨酸含量顯著高于CK，分別比CK高 44.64%、78.78%、250.00%、208.93%、242.86%、50.00%、57.14%、184.82%、87.50%、119.64%、95.53%(圖5-B)。

3 討論與結(jié)論

煙草雖為氯敏感作物，但氯元素也是煙草生長發(fā)育過程中必需的營養(yǎng)元素之一，雖需求量很少卻不可替代[1]。氯是構(gòu)成煙草葉綠體和光合反應(yīng)中輔酶的不可或缺的元素，Cl-在光合電子傳遞中能夠平衡電荷，保證光合作用的順利進行[15]；Cl-可維持細胞的滲透壓和膨壓，減少植株水分喪失，保持葉片的固有形態(tài)[16]，調(diào)控氣孔開度，提高煙草抗逆性[17]等。當土壤中氯含量無法滿足煙草對氯元素的正常需求時，需施用含氯化肥或有機肥以補充氯素營養(yǎng)。適量的氯元素可提高煙草葉片產(chǎn)量[3]，在一定范圍內(nèi)，煙葉產(chǎn)量隨施氯量的增加而相應(yīng)地增加[18-19]。含氯量適合的煙葉膨壓高，挺立面積大、時間長，吸收光照充足，光合效率高，因此適量的氯元素能夠提高煙葉的產(chǎn)量和產(chǎn)值，但氯元素超過一定的范圍時，煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值都明顯下降[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，50 mmol/L NaCl處理后煙草株高最大，25 mmol/L CaCl2處理后莖直徑最大，75 mmol/L CaCl2處理后的根冠比最大；除CK外，100 mmol/L NaCl處理后的總生物量最大。50 mmol/L NaCl處理后的葉片厚度最大，150 mmol/L KCl處理的葉片厚度則顯著小于其他處理；50 mmol/L KCl和CaCl2處理后煙草葉片寬度顯著小于CK，50、100 mmol/L KCl處理后的葉形指數(shù)最大。結(jié)果表明，不同氯化物的不同濃度對煙草的植株和葉片形態(tài)特征影響較大，100 mmol/L NaCl處理對煙草增產(chǎn)效果較好。

施用適量氯肥有利于提高煙草的根系活力[21]，這與本研究的結(jié)果相似，100 mmol/L KCl和25 mmol/L CaCl2處理后煙草的根系活力顯著高于其他處理，75 mmol/L MgCl2處理后則略高于CK。丙二醛是植物細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，丙二醛含量升高，說明植物細胞膜受到氧化破壞，其含量越高，破壞程度越大。李春雷報道，低濃度氯對幼齡茶樹不會造成傷害，但氯離子濃度超過20 mmoL/L時則造成嚴重傷害[12]。本研究結(jié)果顯示，100 mmol/L和150 mmol/L NaCl，50 mmol/L KCl，25、50、75 mmol/L CaCl2處理后的丙二醛含量顯著高于其他處理，說明這些處理后對煙草葉片細胞膜的傷害較大。超氧化物歧化酶和過氧化物酶是植物在長期進化過程中形成的可有效清除活性氧的酶類，在正常情況下，這些酶能夠使植物體內(nèi)的活性氧處于產(chǎn)生和消除的動態(tài)平衡，避免細胞受到傷害。SOD是植物細胞免受活性氧傷害的第一道防線[22]，將氧自由基歧化為H2O2，然后再由POD和CAT進一步將H2O2催化形成水，徹底清除氧自由基的傷害。在低濃度氯離子脅迫下，SOD、POD活性逐漸上升，但隨著氯離子濃度的升高，積累的活性氧超出了其清除能力，SOD、POD活性也隨之下降[12]。H2O2含量的持續(xù)升高將加劇膜質(zhì)過氧化物反應(yīng)，使丙二醛含量升高，造成膜損傷。本研究中，50、100 mmol/L KCl處理后的SOD活性顯著高于其他處理，50、100 mmol/L NaCl，75 mmol/L CaCl2，75 mmol/L MgCl2處理后的SOD活性也顯著高于CK；25 mmol/L MgCl2處理后的POD活性顯著高于其他處理，50 mmol/L MgCl2處理后的POD活性顯著高于CK；4種氯化物的不同濃度處理后，煙草葉片的氧自由基產(chǎn)生速率和過氧化氫含量均高于CK，其中75 mmol/L MgCl2處理后的氧自由基產(chǎn)生速率最高，100、150 mmol/L NaCl處理后的過氧化氫含量最高；而50 mmol/L NaCl，50 mmol/L KCl處理后的氧自由基產(chǎn)生速率最低。

氯元素廣泛分布在煙草的各器官中，與煙草的品質(zhì)密切相關(guān)。適宜的氯含量能夠提高煙葉的產(chǎn)量，但若氯含量過多，煙葉淀粉積累過多，來不及分解轉(zhuǎn)化為蔗糖，阻礙了光合作用的進行，致使產(chǎn)量下降[18]。從生理角度來看，決定煙草品質(zhì)的可溶性總糖、蛋白質(zhì)、煙堿含量及其比例等與碳氮代謝有密切的關(guān)系[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，150 mmol/L KCl，50 mmol/L CaCl2處理后煙草葉片可溶性糖含量顯著高于CK；25 mmol/L MgCl2處理后的煙草葉片淀粉含量顯著高于其他處理，50 mmol/L CaCl2，50、75 mmol/L MgCl2處理后的淀粉含量顯著高于CK；50、75 mmol/L MgCl2處理后可溶性蛋白質(zhì)含量顯著低于CK。脯氨酸是植物細胞抗氧化系統(tǒng)中重要的非酶類物質(zhì)，在清除活性氧方面起著關(guān)鍵作用，是植物重要的抗逆生理指標[24-25]。隨著氯離子濃度的增加，脯氨酸含量顯著升高，表明脯氨酸在清除活性氧方面起到了重要作用[12]，本研究也得到了類似的結(jié)果，4種氯化物的不同濃度處理后游離脯氨酸含量均高于CK，但100 mmol/L NaCl處理后與CK差異不顯著。