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        1株喹啉降解菌的篩選及其降解特性

        2018-09-10 07:11:50鄧冬梅梁秀芬萬美玲吳桂珍陳業(yè)祖孫宇飛
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年15期
        關(guān)鍵詞:威登喹啉菌液

        鄧冬梅, 梁秀芬, 李 晴, 何 勍, 萬美玲, 吳桂珍, 韋 烽, 陳業(yè)祖, 孫宇飛

        (廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院/廣西糖資源綠色加工重點實驗室,廣西柳州 545006)

        喹啉是一類降解性能很差的復(fù)雜有機物,是很多殺蟲劑的主要成分,會導(dǎo)致土壤農(nóng)藥殘留污染[1]。作為一種典型的氮雜環(huán)芳烴化合物,喹啉具有較大的毒性和間接的致突變性[2],對環(huán)境有很大的潛在危害,應(yīng)使污染土壤中的喹啉進行有效降解。目前喹啉的降解有物理、化學(xué)和生物方法,其中生物降解喹啉具有成本低、對環(huán)境無二次污染、易于操作等優(yōu)點,是目前研究喹啉降解的熱點[3]。自從從土壤中分離出能降解喹啉的莫拉氏菌(Moraxellasp.)[4]及假單胞菌(Pseudomonassp.)[5]菌株后,目前已有多種喹啉降解菌被分離,如紅球菌(Rhodococcussp.)[6]、假伯克霍爾德菌(Burkholderiapickettii)[7]、叢毛單胞菌屬(Comamonassp.)[8]、脫硫微菌(Desulfobacteriumindolicum)[9]、白腐真菌[10]等。

        為達到穩(wěn)定高效的去除效果,菌株間的復(fù)配已成為共識,為此需要更多高效喹啉降解菌提供復(fù)配菌源。此外,環(huán)境因素也是實際處理工程中影響去除效果的主要因素。因此本研究希望通過篩選喹啉降解菌,并考察環(huán)境因素對降解菌的影響,以期為生物固定化等方法去除環(huán)境中的喹啉提供菌源。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        1.1.1 菌株 菌株篩選自柳鋼焦化廢水A/O生物處理系統(tǒng)的O池中活性污泥。

        1.1.2 培養(yǎng)基 細菌富集培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基,包含10 g/L胰蛋白胨、3 g/L牛肉膏、5 g/L NaCl,pH值為7.2~7.6。細菌分離和降解試驗中,培養(yǎng)基為無機鹽培養(yǎng)基(mineral salt medium,MSM)[11],包含4.26 g/L Na2HPO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O、0.02 g/L CaC12、0.05 mg/L KI、2 mg/L MnSO4·4H2O、0.2 mg/L CuSO4·2H2O、2 mg/L ZnSO4·7H2O、2.5 mg/L Na2MoO4·2H2O、0.082 mg/L H3BO3、1 mg/L FeC13·6H2O,喹啉(根據(jù)需要加入),pH值為7.2~7.6。固體培養(yǎng)基為在液體培養(yǎng)基中投加15 g/L瓊脂。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 菌種的馴化和分離 取5 mL活性污泥,至LB培養(yǎng)基中富集培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后依次轉(zhuǎn)移到含喹啉50、100、200、300、400、500 mg/L的MSM培養(yǎng)基中,30 ℃、120 r/min各馴化培養(yǎng)6 d。馴化后菌液經(jīng)在LB培養(yǎng)基上涂布稀釋分離及平板劃線純化后得到純菌株,編號為L-F。將L-F菌接種于LB培養(yǎng)基中富集培養(yǎng),富集的純菌保存在15%的甘油中,存于-60 ℃冰箱中待用。

        1.2.2 16S rRNA鑒定 利用細菌鑒定的通用引物27F和1492R[12]對菌液進行PCR片段基因擴增,引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系(50 μL)包括25 μL DNA聚合酶mix、菌液模板4 μL、去離子水17 μL、上下游引物各 0.5 μL。PCR溫度程序為:94 ℃預(yù)變性8 min;94 ℃變性 1 min,58 ℃退火 1 min,72 ℃延伸1 min,循環(huán)29次;最后 72 ℃ 終延伸10 min,4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,并利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(中國康寧生命科學(xué)有限公司)對PCR產(chǎn)物進行純化。將回收的DNA送往上海立菲生物技術(shù)有限公司廣州分公司進行序列測定,并將序列在NCBI網(wǎng)頁上進行Blast同源性比對。

        1.2.3 菌株降解條件及降解特性研究 以喹啉降解率為指標(biāo),利用單因素試驗研究pH值、溫度和初始苯酚濃度對菌株生長及降解喹啉的影響,根據(jù)環(huán)境單因素試驗結(jié)果,用 Design-Expert軟件生成3水平3因素組合條件(表1),根據(jù)所生成的各組合條件搖床培養(yǎng)菌株,測定培養(yǎng)6 d后喹啉濃度,計算降解率,所得結(jié)果輸入Design-Expert軟件,生成分析。將L-F菌在響應(yīng)面法所確定的最優(yōu)條件下進行搖床培養(yǎng),每隔2 h測定喹啉濃度和菌液濃度,繪制生長曲線和喹啉降解曲線。

        表1 響應(yīng)面分析因素與水平

        1.2.4 分析方法 菌種濃度的測定采用比濁法,使用分光光度計于波長600 nm處測定其D值[13]。喹啉含量測定采用紫外分光光度法[14],使用分光光度計于波長313 nm處測定其D值。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 喹啉降解菌篩選與鑒定

        馴化過程中,培養(yǎng)液出現(xiàn)由無色→粉紅色→紫紅色→淺褐色的變化,與假單胞菌(Pseudomonassp.QG6)降解喹啉過程中顏色變化[15]相似,其顏色變化是降解喹啉的中間產(chǎn)物所致,初步說明搖瓶中的菌也具有喹啉降解特性。經(jīng)平板劃線分離,得到1株菌,命名為L-F菌株。L-F的16S rRNA序列與數(shù)據(jù)庫GenBank中的Providenciasp.序列同源性達99%,初步鑒定L-F菌株為普羅威登斯菌(Providenciasp.)。普羅威登斯菌(Providenciasp.)中雷氏普羅威登斯菌(Provideaciarettgeri)[16]被證明有脫氮性能,而喹啉屬于氮雜環(huán)類化合物,其降解與脫氮[17]有關(guān),但該菌并未研究其喹啉降解特性,其降解喹啉的機制有待進一步研究。

        2.2 L-F菌株降解條件研究

        2.2.1 喹啉初始濃度對降解率的影響 由圖1可知,喹啉初始濃度由100 mg/L增加到900 mg/L,L-F對喹啉降解率先增大后減小,但增大或減小幅度并不是很明顯,其中喹啉濃度700 mg/L時L-F的降解率最高。

        2.2.2 pH值對菌株喹啉降解率的影響 如圖2所示,當(dāng)pH值<7.5時,L-F對喹啉的降解率隨pH值的增加而增大;當(dāng)pH值為7.5時,喹啉降解率達最高值97%;當(dāng)pH值>7.5時,降解率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢,但下降幅度不大,降解率依然高于90%。

        2.2.3 溫度對菌株喹啉降解率的影響 如圖3所示,溫度由20 ℃增加到40 ℃時,L-F對喹啉的降解效率先增大后減小,30 ℃時,L-F對喹啉降解率最強。

        2.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化菌株喹啉降解條件 如表2所示,在設(shè)計的試驗條件下,喹啉最大降解率達到96%,最小降解率為67%。將表2中的結(jié)果導(dǎo)入Design-Expert軟件,固定1個環(huán)境因素的情況下,以另外2個環(huán)境因素為x和y軸,以降解率為z軸作圖,得到在不同降解條件下的喹啉降解率響應(yīng)曲面。如圖4所示,溫度和pH值對降解率的交互影響最顯著,而溫度和底物濃度、pH值和底物濃度對降解率的交互影響不太顯著。

        由圖3還可知,L-F菌株降解喹啉的最優(yōu)條件為:溫度30 ℃,pH值7.5,底物濃度700 mg/L,在此條件下培養(yǎng)6 d后,對喹啉的降解效率達96%,和發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)[18]等高效喹啉降解菌株的降解能力相當(dāng)。

        2.2.5 菌種生長曲線及降解特性 由圖5可知,0~15 h時L-F生長緩慢,可能是因為于喹啉抑制了菌株的生長;15~42 h之間為對數(shù)生長期。但喹啉降解速度基本穩(wěn)定,喹啉濃度逐步降低,50 h時喹啉降解率已達80%,此降解規(guī)律和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)有一定差異。王培明等發(fā)現(xiàn),惡臭假單胞菌(P.putida)在對數(shù)生長期喹啉降解率最高[19]。降解特性的不同可能和菌株對喹啉的降解機制有關(guān)。

        表2 響應(yīng)面組合條件及對應(yīng)降解率

        3 結(jié)論

        經(jīng)過以喹啉為唯一碳源,從柳鋼焦化廢水中篩選出了1株具有降解喹啉能力的菌株L-F,經(jīng)16S rDNA測序鑒定為普羅威登斯菌(Providenciasp.)。L-F降解喹啉的最優(yōu)條件為:溫度30 ℃,pH值7.5,喹啉初始濃度700 mg/L。該條件下?lián)u床培養(yǎng)6 d后,喹啉降解率高達96%。

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