鄧冬梅， 梁秀芬， 李 晴， 何 勍， 萬美玲， 吳桂珍， 韋 烽， 陳業(yè)祖， 孫宇飛

(廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院/廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州 545006)

喹啉是一類降解性能很差的復(fù)雜有機(jī)物，是很多殺蟲劑的主要成分，會導(dǎo)致土壤農(nóng)藥殘留污染[1]。作為一種典型的氮雜環(huán)芳烴化合物，喹啉具有較大的毒性和間接的致突變性[2]，對環(huán)境有很大的潛在危害，應(yīng)使污染土壤中的喹啉進(jìn)行有效降解。目前喹啉的降解有物理、化學(xué)和生物方法，其中生物降解喹啉具有成本低、對環(huán)境無二次污染、易于操作等優(yōu)點，是目前研究喹啉降解的熱點[3]。自從從土壤中分離出能降解喹啉的莫拉氏菌(Moraxellasp.)[4]及假單胞菌(Pseudomonassp.)[5]菌株后，目前已有多種喹啉降解菌被分離，如紅球菌(Rhodococcussp.)[6]、假伯克霍爾德菌(Burkholderiapickettii)[7]、叢毛單胞菌屬(Comamonassp.)[8]、脫硫微菌(Desulfobacteriumindolicum)[9]、白腐真菌[10]等。

為達(dá)到穩(wěn)定高效的去除效果，菌株間的復(fù)配已成為共識，為此需要更多高效喹啉降解菌提供復(fù)配菌源。此外，環(huán)境因素也是實際處理工程中影響去除效果的主要因素。因此本研究希望通過篩選喹啉降解菌，并考察環(huán)境因素對降解菌的影響，以期為生物固定化等方法去除環(huán)境中的喹啉提供菌源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 菌株篩選自柳鋼焦化廢水A/O生物處理系統(tǒng)的O池中活性污泥。

1.1.2 培養(yǎng)基 細(xì)菌富集培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基，包含10 g/L胰蛋白胨、3 g/L牛肉膏、5 g/L NaCl，pH值為7.2～7.6。細(xì)菌分離和降解試驗中，培養(yǎng)基為無機(jī)鹽培養(yǎng)基(mineral salt medium，MSM)[11]，包含4.26 g/L Na2HPO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O、0.02 g/L CaC12、0.05 mg/L KI、2 mg/L MnSO4·4H2O、0.2 mg/L CuSO4·2H2O、2 mg/L ZnSO4·7H2O、2.5 mg/L Na2MoO4·2H2O、0.082 mg/L H3BO3、1 mg/L FeC13·6H2O，喹啉(根據(jù)需要加入)，pH值為7.2～7.6。固體培養(yǎng)基為在液體培養(yǎng)基中投加15 g/L瓊脂。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的馴化和分離 取5 mL活性污泥，至LB培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后依次轉(zhuǎn)移到含喹啉50、100、200、300、400、500 mg/L的MSM培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min各馴化培養(yǎng)6 d。馴化后菌液經(jīng)在LB培養(yǎng)基上涂布稀釋分離及平板劃線純化后得到純菌株，編號為L-F。將L-F菌接種于LB培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，富集的純菌保存在15%的甘油中，存于-60 ℃冰箱中待用。

1.2.2 16S rRNA鑒定 利用細(xì)菌鑒定的通用引物27F和1492R[12]對菌液進(jìn)行PCR片段基因擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系(50 μL)包括25 μL DNA聚合酶mix、菌液模板4 μL、去離子水17 μL、上下游引物各 0.5 μL。PCR溫度程序為：94 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性 1 min，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)29次；最后 72 ℃ 終延伸10 min，4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(中國康寧生命科學(xué)有限公司)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。將回收的DNA送往上海立菲生物技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行序列測定，并將序列在NCBI網(wǎng)頁上進(jìn)行Blast同源性比對。

1.2.3 菌株降解條件及降解特性研究 以喹啉降解率為指標(biāo)，利用單因素試驗研究pH值、溫度和初始苯酚濃度對菌株生長及降解喹啉的影響，根據(jù)環(huán)境單因素試驗結(jié)果，用 Design-Expert軟件生成3水平3因素組合條件(表1)，根據(jù)所生成的各組合條件搖床培養(yǎng)菌株，測定培養(yǎng)6 d后喹啉濃度，計算降解率，所得結(jié)果輸入Design-Expert軟件，生成分析。將L-F菌在響應(yīng)面法所確定的最優(yōu)條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，每隔2 h測定喹啉濃度和菌液濃度，繪制生長曲線和喹啉降解曲線。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.2.4 分析方法 菌種濃度的測定采用比濁法，使用分光光度計于波長600 nm處測定其D值[13]。喹啉含量測定采用紫外分光光度法[14]，使用分光光度計于波長313 nm處測定其D值。

2 結(jié)果與分析

2.1 喹啉降解菌篩選與鑒定

馴化過程中，培養(yǎng)液出現(xiàn)由無色→粉紅色→紫紅色→淺褐色的變化，與假單胞菌(Pseudomonassp.QG6)降解喹啉過程中顏色變化[15]相似，其顏色變化是降解喹啉的中間產(chǎn)物所致，初步說明搖瓶中的菌也具有喹啉降解特性。經(jīng)平板劃線分離，得到1株菌，命名為L-F菌株。L-F的16S rRNA序列與數(shù)據(jù)庫GenBank中的Providenciasp.序列同源性達(dá)99%，初步鑒定L-F菌株為普羅威登斯菌(Providenciasp.)。普羅威登斯菌(Providenciasp.)中雷氏普羅威登斯菌(Provideaciarettgeri)[16]被證明有脫氮性能，而喹啉屬于氮雜環(huán)類化合物，其降解與脫氮[17]有關(guān)，但該菌并未研究其喹啉降解特性，其降解喹啉的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.2 L-F菌株降解條件研究

2.2.1 喹啉初始濃度對降解率的影響 由圖1可知，喹啉初始濃度由100 mg/L增加到900 mg/L，L-F對喹啉降解率先增大后減小，但增大或減小幅度并不是很明顯，其中喹啉濃度700 mg/L時L-F的降解率最高。

2.2.2 pH值對菌株喹啉降解率的影響 如圖2所示，當(dāng)pH值<7.5時，L-F對喹啉的降解率隨pH值的增加而增大；當(dāng)pH值為7.5時，喹啉降解率達(dá)最高值97%；當(dāng)pH值>7.5時，降解率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，但下降幅度不大，降解率依然高于90%。

2.2.3 溫度對菌株喹啉降解率的影響 如圖3所示，溫度由20 ℃增加到40 ℃時，L-F對喹啉的降解效率先增大后減小，30 ℃時，L-F對喹啉降解率最強。

2.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化菌株喹啉降解條件 如表2所示，在設(shè)計的試驗條件下，喹啉最大降解率達(dá)到96%，最小降解率為67%。將表2中的結(jié)果導(dǎo)入Design-Expert軟件，固定1個環(huán)境因素的情況下，以另外2個環(huán)境因素為x和y軸，以降解率為z軸作圖，得到在不同降解條件下的喹啉降解率響應(yīng)曲面。如圖4所示，溫度和pH值對降解率的交互影響最顯著，而溫度和底物濃度、pH值和底物濃度對降解率的交互影響不太顯著。

由圖3還可知，L-F菌株降解喹啉的最優(yōu)條件為：溫度30 ℃，pH值7.5，底物濃度700 mg/L，在此條件下培養(yǎng)6 d后，對喹啉的降解效率達(dá)96%，和發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)[18]等高效喹啉降解菌株的降解能力相當(dāng)。

2.2.5 菌種生長曲線及降解特性 由圖5可知，0～15 h時L-F生長緩慢，可能是因為于喹啉抑制了菌株的生長；15～42 h之間為對數(shù)生長期。但喹啉降解速度基本穩(wěn)定，喹啉濃度逐步降低，50 h時喹啉降解率已達(dá)80%，此降解規(guī)律和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)有一定差異。王培明等發(fā)現(xiàn)，惡臭假單胞菌(P.putida)在對數(shù)生長期喹啉降解率最高[19]。降解特性的不同可能和菌株對喹啉的降解機(jī)制有關(guān)。

表2 響應(yīng)面組合條件及對應(yīng)降解率

3 結(jié)論

經(jīng)過以喹啉為唯一碳源，從柳鋼焦化廢水中篩選出了1株具有降解喹啉能力的菌株L-F，經(jīng)16S rDNA測序鑒定為普羅威登斯菌(Providenciasp.)。L-F降解喹啉的最優(yōu)條件為：溫度30 ℃，pH值7.5，喹啉初始濃度700 mg/L。該條件下?lián)u床培養(yǎng)6 d后，喹啉降解率高達(dá)96%。