林少華 羅紅霞 許文濤 寥國(guó)周 商 穎 葛長(zhǎng)榮*

（1北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442；2中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；4昆明理工大學(xué)食品安全研究院，云南昆明 650093）

為了保證消費(fèi)者的飲食衛(wèi)生與食用安全，中國(guó)規(guī)定了動(dòng)物源食品中獸藥的最大殘留限量（Maximum Residue Limits,MRL）[1]，然而隨著獸藥的廣泛使用，引起了人們一系列的不良反應(yīng)，對(duì)人體和動(dòng)物的機(jī)體造成了一定的損傷，因此，獸藥在動(dòng)物源食品中的殘留問(wèn)題越來(lái)越受到人們的關(guān)注。氟喹諾酮類(lèi)藥物（Fluoroquinolones,FQs）是一類(lèi)近年來(lái)被廣泛應(yīng)用的對(duì)許多細(xì)菌具有抑制作用的人工合成獸藥[2]，它對(duì)金黃色葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、衣原體、支原體、螺旋體等致病菌具有極強(qiáng)的抑制作用，適用于臨床常見(jiàn)的各種細(xì)菌感染性疾病，已成為繼青霉素類(lèi)藥物和磺胺類(lèi)藥物之后治療畜禽疾病的第三代喹諾酮類(lèi)藥物[3]。然而，長(zhǎng)期使用FQs會(huì)積累在動(dòng)物體內(nèi)，當(dāng)身體的累積攝入量超過(guò)限制時(shí)，中毒癥狀如皮膚過(guò)敏、出血和腎功能衰竭等不良反應(yīng)[4]將會(huì)出現(xiàn)，并會(huì)誘發(fā)精神病及癲癇患者發(fā)病[5]，具有潛在的致癌性[6]等。因此，氟喹諾酮類(lèi)藥物已經(jīng)被大多數(shù)國(guó)家禁止或限制使用。

目前，關(guān)于氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)方法主要有微生物法、化學(xué)發(fā)光法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和免疫分析法[7-11]。膠體金免疫層析法是一種利用膠體金作為標(biāo)記物并基于抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)，該技術(shù)操作簡(jiǎn)單快速，可直觀判斷檢測(cè)結(jié)果[12]。目前，已有的研究包括了肉、蛋、奶的FQs膠體金免疫層析方法[13-14]，但采用膠體金試紙條對(duì)豬尿中的FQs直接進(jìn)行檢測(cè)，可以解決篩查生豬大規(guī)模樣品時(shí)采用儀器法周期長(zhǎng)、對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員要求高及檢測(cè)成本昂貴等問(wèn)題。因此，本文擬建立一種快速檢測(cè)豬尿中FQs的膠體金免疫層析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、依諾沙星、惡喹酸等標(biāo)準(zhǔn)品，氯金酸（HAuCl4·4H2O）、檸檬酸三鈉、牛血清白蛋白（BSA），羊抗鼠IgG均購(gòu)自Sigma公司；FQs單克隆抗體和包被抗原（FQs-OVA）由本實(shí)驗(yàn)室制備；硝酸纖維素膜、結(jié)合墊、樣品墊、吸收墊均購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；其他試劑均為分析純；豬尿樣本采自北京某豬場(chǎng)。

1.2 儀器

Mili-Q超純水系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；磁力攪拌器購(gòu)自上海振榮科學(xué)儀器有限公司；試紙條劃線儀購(gòu)自美國(guó)Biodot公司；可編程切條器購(gòu)自杭州峰航科技有限公司；切紙器購(gòu)自寧波得力集團(tuán)有限公司；分析天平購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司；手持式pH計(jì)購(gòu)自上海般特儀器有限公司；臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Scilogex公司；生化培養(yǎng)箱DHP-600購(gòu)自天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；透射電子顯微鏡（TEM）購(gòu)自美國(guó)JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 膠體金溶液的制備

準(zhǔn)確稱取1.0 g氯金酸，并使用超純水將其定容于100 mL容量瓶中，制備成濃度為1%的氯金酸溶液，于4℃避光保存?zhèn)溆?。配制膠體金溶液時(shí)，取1 mL濃度為1%的氯金酸溶液加入到100 mL超純水中，用磁力攪拌電熱器加熱至沸騰，然后快速加入2.0 mL現(xiàn)配的體積分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉溶液，保持沸騰10 min，直到液體變紅并停止加熱，降至室溫備用。

1.3.2 膠體金標(biāo)記抗體的制備

取1 mL膠體金溶液，用0.2 mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.2，漩渦震蕩10 min后，加入適量的FQs單克隆抗體，攪拌30 min后，加入體積分?jǐn)?shù)為10%的1 mL牛血清蛋白（BSA），結(jié)合30 min后，將混合溶液在4℃下以12 000 r/min離心20 min，將離心得到的沉淀物溶解于0.1 M的磷酸鹽緩沖液中，制備得到膠體金FQs單克隆抗體溶液，并于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 優(yōu)化膠體金最佳抗體標(biāo)記量

每管加入1 mL上述膠體金溶液，分別加入0、2、4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20 μL 濃 度 為1 mg/mL的FQs單克隆抗體，振蕩混勻5 min，室溫靜置10 min；然后加入0.1 mL 10%的NaCl溶液，混勻并靜置2 h。然后將該膠體金溶液在4℃以12 000 r/min離心20 min，得到上清液，于520 nm處測(cè)定其吸光值。

1.3.4 試紙條的組裝

試紙條由材質(zhì)為玻璃纖維膜的膠體金結(jié)合墊、材質(zhì)為硝酸纖維素膜（NC膜）的層析膜、加樣墊及吸水墊組成。膠體金FQs單克隆抗體溶液用噴膜儀噴在結(jié)合墊上，并在恒溫37℃下烘干，然后真空凍干制成膠體金結(jié)合墊備用。用點(diǎn)膜儀將濃度為1 mg/mL的FQs-OVA偶聯(lián)物包被于NC膜上，制成T線檢測(cè)線，在距離T線4mm處，用點(diǎn)膜儀將濃度為1 mg/mL的羊抗鼠二抗包被于NC膜上，制成C線質(zhì)控線，然后置于37℃烘干3 h。最后以PVC板作背襯，按順序粘上樣品墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊組裝成檢測(cè)試紙條。樣品吸收墊的末端與結(jié)合墊始端相連，結(jié)合墊的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對(duì)齊，試紙兩端粘貼有保護(hù)膜，切成4 mm寬的試紙條，密封好后放入4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 檢測(cè)原理及結(jié)果判斷

由土地綜合承載力方程可知，地均第二、第三產(chǎn)業(yè)增加值以及兩者的聯(lián)合發(fā)展都不是土地綜合承載力的Granger原因。但在10%顯著性水平下，人均GDP是土地綜合承載力的Granger原因。這表明土地綜合承載力主要受人口承載力、資源環(huán)境承載力、經(jīng)濟(jì)社會(huì)承載力及科技文化承載力4個(gè)構(gòu)成要素的影響，客觀上來(lái)看，土地綜合承載力與人均GDP之間的因果關(guān)系日趨顯現(xiàn)。

當(dāng)樣品中含有FQs時(shí)，膠體金FQs單克隆抗體標(biāo)記物與FQs結(jié)合，不與FQs-OVA偶聯(lián)物結(jié)合而未出現(xiàn)紅色條帶。基于上述原理，當(dāng)T線和C線均出現(xiàn)紅色條帶時(shí)，判為陰性；當(dāng)C線出現(xiàn)紅色條帶，而T線不顯色，判為陽(yáng)性；當(dāng)C線顯示紅色條帶，T線也顯示紅色條帶，并且T線顏色接近或淺于C線時(shí)，則判為陰性；當(dāng)C線不顯示紅色條帶，則無(wú)論T線是否顯示紅色條帶，都判為無(wú)效（圖1）。

圖1 試紙條檢測(cè)結(jié)果示意圖

1.3.6 豬尿樣品檢測(cè)程序

取100 μL存放于4℃冰箱的豬尿樣品，該樣品無(wú)需進(jìn)行前處理，用吸管吸取待檢樣品溶液滴加3滴到試紙條的加樣孔中，通過(guò)觀察T線和C線的顏色變化判定結(jié)果。

1.3.7 試紙條的檢出限

分別向陰性豬尿樣品中添加恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、依諾沙星和惡喹酸標(biāo)準(zhǔn)品，使得它們的質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40 μg/L。通過(guò)觀察試紙條T線和C線的顏色變化情況對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。

1.3.8 試紙條的特異性

將常用的獸藥如氯霉素、紅霉素、慶大霉素、四環(huán)素等按照質(zhì)量濃度為500 μg/L分別加入到陰性豬尿中，然后用試紙條重復(fù)檢測(cè)3次，以確定試紙條的特異性。

1.3.9 試紙條的穩(wěn)定性

將制備好的試紙條密封包裝在鋁箔袋中，分別進(jìn)行37℃加速試驗(yàn)和4℃儲(chǔ)存試驗(yàn)。將制備好的試紙條置于37℃，分別在10、20、40、80、160、320天取出，檢測(cè)添加了質(zhì)量濃度為0、20、40 μg/L恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品的陰性豬尿樣品，每組3個(gè)平行。將置于4℃下的試紙條，于1、4、8、12、16、20、24個(gè)月取出，檢測(cè)添加了質(zhì)量濃度為0、20、40 μg/L恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品的陰性豬尿樣品，每組3個(gè)平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 膠體金及其FQs單克隆抗體的表征

本研究制備的膠體金納米顆粒及膠體金FQs單克隆抗體表征結(jié)果如圖2所示。利用透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)金納米顆粒和膠體金FQs單克隆抗體的宏觀形貌進(jìn)行了表征，可以清晰看到金納米顆粒分散性良好，尺寸約為40 nm；膠體金FQs單克隆抗體在金納米顆粒周?chē)霈F(xiàn)明亮的圓圈，表明抗體修飾成功。

圖2 金納米顆粒和膠體金FQs單克隆抗體的表征

為了進(jìn)一步驗(yàn)證抗體的成功修飾，測(cè)試了金納米顆粒和膠體金FQs單克隆抗體的紫外-可見(jiàn)吸收光譜的變化。金納米顆粒的最大吸收波長(zhǎng)為520 nm，而膠體金FQs單克隆抗體最大吸收波長(zhǎng)為524 nm，峰值的變化表明抗體修飾成功（圖3）。

圖3 金納米顆粒和膠體金FQs單克隆抗體溶液的紫外-可見(jiàn)光掃描圖譜

2.2 膠體金最佳標(biāo)記抗體的量

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著抗體量的增加，膠體金溶液的顏色由酒紅色緩慢變?yōu)樗{(lán)灰色，表明抗體加入量不能很好地穩(wěn)定膠體金。當(dāng)管內(nèi)膠體金的酒紅色不再發(fā)生明顯變化時(shí)，表明該抗體加入量可以較好地穩(wěn)定膠體金。由圖4可以看出，隨著抗體加入量的增加，金顆粒與蛋白的結(jié)合物在520 nm處的吸光值也增加，當(dāng)FQs單克隆抗體加入量在10 μL時(shí)，OD520nm值基本趨于穩(wěn)定，說(shuō)明金顆粒結(jié)合的抗體蛋白已經(jīng)飽和。

2.3 試紙條的檢測(cè)限

當(dāng)該試紙條用于檢測(cè)含有濃度低于20 μg/L的恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、依諾沙星和惡喹酸的豬尿樣品時(shí)，試紙條T線和C線均顯色，為陰性，而濃度高于20 μg/L時(shí)，該試紙條的T線不顯色而C線顯色，為陽(yáng)性，因此檢出限為20 μg/L。

圖4 不同F(xiàn)Qs加入量膠體金的OD值

2.4 試紙條的特異性

結(jié)果顯示，采用試紙條分別檢測(cè)含有濃度為500 μg/L的氯霉素、紅霉素、慶大霉素、四環(huán)素的豬尿時(shí)，試紙條C線和T線均顯色，因此，本試紙條未對(duì)這些藥物發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.5 試紙條的穩(wěn)定性

試紙條的穩(wěn)定性結(jié)果如表1和表2所示。在37℃加速試驗(yàn)時(shí)，該試紙條在160天時(shí)測(cè)定了含有濃度為20 μg/L恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品的豬尿樣品，有2份已經(jīng)失效；測(cè)定了含有濃度為40 μg/L恩諾沙星的豬尿樣品，有1份已經(jīng)失效。到了320天時(shí)，所有試紙條均失效。4℃保存試驗(yàn)時(shí)，氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留快速檢測(cè)試紙條可以保存24個(gè)月。

表1 37℃加速試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)果與討論

影響膠體金試紙條質(zhì)量的主要因素包括膠體金顆粒的尺寸、膠體金標(biāo)記的抗體量。當(dāng)膠體金的顆粒較大時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一定的空間位阻，不利于樣品的毛細(xì)管遷移，降低試紙條的檢測(cè)時(shí)間和檢出限；但如果膠體金的顆粒太小，難以標(biāo)記更多的單克隆抗體，也會(huì)降低試紙條的檢測(cè)靈敏性。本文采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，利用透射電子顯微鏡對(duì)金納米顆粒和膠體金FQs單克隆抗體進(jìn)行表征，確定所制備的膠體金顆粒及其標(biāo)記的單克隆抗體均一，平均直徑為40 nm；通過(guò)紫外-分光光度計(jì)掃描得到膠體金FQs單克隆抗體最大吸收波長(zhǎng)為524 nm。另外，膠體金的標(biāo)記抗體量也非常關(guān)鍵，抗體標(biāo)記量過(guò)低時(shí)會(huì)產(chǎn)生游離的膠體金，使得膠體金標(biāo)記的單克隆抗體溶液不穩(wěn)定，從而降低檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，同時(shí)，顯色條帶較淺，容易產(chǎn)生結(jié)果誤判；抗體標(biāo)記量過(guò)高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致抗體的浪費(fèi)，并降低檢測(cè)結(jié)果的靈敏性，因此，本試紙條加入的濃度為1 mg/mL的FQs單克隆抗體量為10 μL。該方法制備的試紙條對(duì)含有恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、依諾沙星和惡喹酸等藥物的豬尿樣品的檢出限為20 μg/L，且檢測(cè)的特異性高，在37℃時(shí)可以保存160天左右，在4℃時(shí)，可以保存24個(gè)月。

表2 4℃保存試驗(yàn)結(jié)果