黃靖 劉春英 袁亞芳

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;原球莖;誘導(dǎo);培養(yǎng)基

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.11.002

鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimuraet Migo又稱黑節(jié)草，屬蘭科石斛屬，為蘭科多年生附生草本植物，是一種珍貴的野生藥用植物。石斛屬DendrobiumSw是蘭科Orchidaceae中的第二大屬，迄今全球已發(fā)現(xiàn)有1500多種植物，我國(guó)有70多個(gè)種?，F(xiàn)代藥理研究表明，鐵皮石斛具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、擴(kuò)張血管及抗血小板凝集等作用，因此在臨床上及中藥復(fù)方中被廣泛應(yīng)用[1]。鐵皮石斛蒴果成熟時(shí)易開裂，且種子粒徑小，自然繁殖率低。由于鐵皮石斛生長(zhǎng)條件的特殊性和分布的局限性以及多年的人為過度采挖破壞，自然資源瀕臨枯竭，成為瀕危植物，被列為國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的野生藥材品種。近年來，在鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的推動(dòng)下，大多數(shù)從事鐵皮石斛組織培養(yǎng)的企業(yè)，主要是采用種子播種方式。由于使用的果莢沒有嚴(yán)格把關(guān)，生產(chǎn)出來的種苗分化、混雜現(xiàn)象嚴(yán)重，種植出來的鐵皮石斛品質(zhì)無法得到保證，嚴(yán)重影響了鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，為了保護(hù)和有效利用鐵皮石斛，采用組織培養(yǎng)技術(shù)，大量快速繁殖鐵皮石斛組培苗顯得尤為重要。

組培工廠化生產(chǎn)育苗要求配方穩(wěn)定、繁殖系數(shù)高、成本低和種苗質(zhì)量穩(wěn)定[2]。目前有關(guān)鐵皮石斛快速繁殖研究報(bào)道中，多集中以種子、莖尖、莖段等為外植體，并通過原球莖的增殖與分化來繁殖種苗[3]。

通過莖段原球莖的途徑，生產(chǎn)出的種苗都來源于同一母本，性狀整齊一致，可以解決種子播種的種苗混雜問題，且繁殖系數(shù)高;但是，原球莖誘導(dǎo)的控制難度較大，生產(chǎn)上沒有得到廣泛應(yīng)用[4]。以鐵皮石斛種子誘導(dǎo)原球莖，再通過原球莖的分化、增殖培養(yǎng)而得到大量幼苗，這種快繁方法可加快鐵皮石斛繁殖速度，推進(jìn)工廠化育苗[5]。本研究以福清佳家農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限公司的鐵皮石斛種子、莖段為原材料，采用單因素試驗(yàn)法對(duì)原球莖的誘導(dǎo)和增殖的培養(yǎng)基配方進(jìn)行篩選，以期建立一整套鐵皮石斛莖段原球莖途徑的組培生產(chǎn)技術(shù)流程，應(yīng)用于工廠化生產(chǎn)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自福清佳家農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限公司，種植于基地溫室大棚。

1.1.1莖段的處理選擇健康、無病蟲害為害的當(dāng)年生鐵皮石斛嫩莖，去除葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2成熟蒴果的處理采集鐵皮石斛成熟蒴果，經(jīng)過表面消毒處理，剖開蒴果取出種子接種到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1莖段消毒莖段先用自來水沖洗干凈，再用流水沖洗5 min，然后用無菌濾紙吸干表面水分。在超凈工作臺(tái)上，將莖段剪成3 cm長(zhǎng)的小段，每段帶1～2個(gè)莖節(jié)。先用75%酒精浸泡30 s，再放入0.1 L汞溶液中浸泡6 min;之后用無菌水沖洗3次，再用無菌濾紙吸干，在無菌碟子上切去兩端傷口，并切成帶一個(gè)節(jié)的小段，接種到不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2蒴果的消毒將鐵皮石斛的蒴果先用自來水沖洗干凈，再置于洗潔精溶液中搖洗10 min，取出蒴果用自來水洗凈，瀝干水后，在超凈工作臺(tái)上先用75%的酒精消毒2 min;倒去酒精，再用0.1%升汞消毒15 min;倒去升汞消毒液，用無菌水沖洗4～5次，瀝干備用。接種時(shí)，將經(jīng)過表面消毒的蒴果放在無菌的不銹鋼盤上，切除頭尾約0.5 cm，然后將蒴果中段沿縱軸切開，取出種子，均勻地接種到培養(yǎng)基表面。

1.2.3原球莖的誘導(dǎo)莖段及種子均以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置8個(gè)處理，分別添加不同濃度的NAA（表1）。將材料接種在原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種5個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種10個(gè)外植體，30 d后統(tǒng)計(jì)原球莖的誘導(dǎo)情況。

2結(jié)果與分析

2.1不同外植體及激素對(duì)原球莖誘導(dǎo)的影響

接種10 d起，外植體均開始萌發(fā)，30 d左右可明顯看到膨大的原球莖，且部分原球莖開始分化出芽尖。60 d左右可明顯看到分化出的小苗。

由表3可以看出，不同處理種子均可萌發(fā)誘導(dǎo)出原球莖，而以種子為外植體的原球莖誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于以莖段為外植體的誘導(dǎo)率，其中以MS為基本培養(yǎng)基處理原球莖誘導(dǎo)率均高于以1/2MS為基本培養(yǎng)基處理。MS添加NAA 0.1 mg·L-1處理的原球莖誘導(dǎo)率高達(dá)98.7%，處理4的誘導(dǎo)率最低，為41.6%。由此可以看出，NAA濃度過高抑制幼苗分化，而低濃度NAA有利于促進(jìn)幼苗分化。

綜合原球莖誘導(dǎo)和分化情況可知，MS中添加0.1 mg·L-1 NAA可有效促進(jìn)鐵皮石斛種子萌發(fā)和發(fā)育。

2.2不同激素濃度對(duì)原球莖增殖的影響

從表4可以看出，鐵皮石斛的原球莖體具有較強(qiáng)的增殖能力。即使只在基本培養(yǎng)基中，經(jīng)60 d培養(yǎng)后，其增殖系數(shù)仍可高達(dá)21.4。在添加NAA 0.1 mg·L-1的條件下，6BA的最佳用量為0.5 mg·L-1，即處理③，鐵皮石斛原球莖體的增殖系數(shù)高達(dá)45.8。該處理中每瓶接入5個(gè)原球莖體，經(jīng)60 d培養(yǎng)后，最多的1瓶增殖出的原球莖體數(shù)多達(dá)297個(gè)，統(tǒng)計(jì)5瓶，共增殖出2290個(gè)原球莖體。繼續(xù)增加6BA用量后，原球莖增殖系數(shù)反而下降，當(dāng)6BA用量達(dá)到2.0 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)開始下降至34.9。

3結(jié)果與討論

原球莖誘導(dǎo)是鐵皮石斛原球莖途徑組織培養(yǎng)的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，誘導(dǎo)率的高低直接影響組培工廠化生產(chǎn)的成本。常規(guī)組培手段采用的原球莖誘導(dǎo)多使用鐵皮石斛莖段及莖尖為外植體，誘導(dǎo)率普遍低于50%，本研究通過接種成熟種子對(duì)原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選發(fā)現(xiàn)，在MS+NAA 0.1 mg·L-1+瓊脂7.0 g·L-1+蔗糖30.0g·L-1上，鐵皮石斛成熟種子萌發(fā)誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖比率高達(dá)98.7%。在MS+NAA 0.1 mg·L-1+6BA 0.5 mg·L-1+瓊脂7.0 g·L-1+蔗糖30.0 g·L-1上，原球莖能大量進(jìn)行增殖。試驗(yàn)結(jié)果也表明添加一定濃度的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素能有效促進(jìn)鐵皮石斛原球莖的誘導(dǎo)，但濃度過高或過低均不利于原球莖的誘導(dǎo)及增殖。

組織培養(yǎng)獲得鐵皮石斛再生植株的途徑有多種，關(guān)于利用成熟種子進(jìn)行快繁，文獻(xiàn)報(bào)道較多的是用成熟的種子消毒后進(jìn)行無菌播種形成原球莖，并經(jīng)過增殖、分化發(fā)育成完整植株[5]。本研究主要是采用將種子消毒后無菌播種誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，增殖原球莖，再通過轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基促進(jìn)小苗增殖的方法，進(jìn)而達(dá)到快繁的目的。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯：柯文輝）