劉微艷 朱沁泉 陳盼 陳創(chuàng) 張滌

〔摘要〕 目的 觀察健脾柔肝息風(fēng)湯對(duì)抽動(dòng)障礙（tic disorder，TD）模型大鼠腦組織中多巴胺和高香草分組干預(yù)后酸（homovanillic acid， HVA）含量的影響，探討其作用機(jī)制。方法 建立空白組，模型組，氟哌啶醇組，健脾柔肝息風(fēng)湯高、中、低劑量組共6組，通過腹腔注射亞氨基二丙腈，建立抽動(dòng)障礙模型大鼠，分組干預(yù)后再采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定腦組織中多巴胺（dopamine， DA）和高香草酸（homovanillic acid， HVA）的含量。結(jié)果 與空白組比較，模型對(duì)照組DA及HVA含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，健脾柔肝息風(fēng)湯高、中、低劑量組及氟哌啶醇組DA與HVA含量均升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 DA能系統(tǒng)及代謝產(chǎn)物HVA平衡失調(diào)與抽動(dòng)障礙發(fā)病有關(guān)，而健脾柔肝息風(fēng)湯具有調(diào)節(jié)DA能系統(tǒng)及代謝產(chǎn)物平衡的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 健脾柔肝息風(fēng)湯，抽動(dòng)障礙;多巴胺;高香草酸

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R749.94? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.12.007

抽動(dòng)障礙（tic disorder， TD）是一種具有遺傳傾向的神經(jīng)精神性疾病，主要表現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)性抽動(dòng)和發(fā)聲性抽動(dòng)，臨床表現(xiàn)有：努嘴、眨眼、聳肩、鼓腹、踢腿等，嚴(yán)重影響了患兒的生活及發(fā)展，且此病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1-2]。抽動(dòng)障礙分為短暫性抽動(dòng)障礙、慢性抽動(dòng)障礙和多發(fā)性抽動(dòng)癥三種類型，目前治療抽動(dòng)障礙的藥物以多巴胺受體拮抗劑為主，其中氟哌啶醇為首選藥物，但其錐體外系等副作用明顯[3]。中醫(yī)認(rèn)為此病與肝脾密切相關(guān)，肝常有余，肝旺生風(fēng)，脾常不足，脾虛生風(fēng)，風(fēng)勝則動(dòng)。張滌教授在臨床中應(yīng)用“抑木扶土”法，研發(fā)了治療此病的經(jīng)驗(yàn)用方——健脾柔肝息風(fēng)湯（茯苓10 g，白芍10 g，鉤藤10 g，僵蠶10 g，全蝎6 g，甘草2 g），此方具有療效顯著、副作用小的優(yōu)勢(shì)，為進(jìn)一步明確其作用，本實(shí)驗(yàn)通建立TD大鼠模型，研究健脾柔肝息風(fēng)湯對(duì)TD大鼠腦組織中多巴胺（dopamine， DA）、高香草酸（homovanillic acid， HVA）含量影響，探討健脾柔肝息風(fēng)湯的作用靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠60只，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～200 g[4-5]，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。許可證號(hào)：SYXK（湘2013-0004）。

1.2? 藥品與試劑

健脾柔肝息風(fēng)湯方由茯苓、白芍、鉤藤、僵蠶、全蝎、甘草組成，含生藥量48 g，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，按照臨床等效劑量的4倍、2倍、1倍高劑量組12 g/（kg·d）、中劑量組6 g/（kg·d）、低劑量組3 g/（kg·d），然后分別按含生藥0.48、0.24、0.12 g/mL配制成健脾柔肝息風(fēng)湯藥液。氟哌啶醇（湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格1 mL∶5 mg）。生理鹽水（湖南科倫制藥有限公司，規(guī)格：100 mL∶0.9 g）等。

DA ELISA試劑盒（武漢華美，批號(hào)：CSB-E08660r），HVA ELISA試劑盒（武漢華美，批號(hào)：CSB-EQ07785RA），考馬斯亮藍(lán)快速染色液（前塵生物，20309ES03），甘氨酸（Biosharp，批號(hào)：BS003A），亞氨基二丙腈（湖南康合益生物科技有限公司）。

1.3? 主要儀器

H1650R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湘儀;PW-812全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)，匯松;MB-530多功能酶標(biāo)分析儀，匯松;DHP-500恒溫培養(yǎng)箱，光明;L530自動(dòng)平衡離心機(jī)，湘儀;MCT-150-C1.5 mL離心管，Axygen。

1.4? 分組與造模[6]

60只SD大鼠隨機(jī)分為6組，空白組、模型組、氟哌啶醇組、健脾柔肝息風(fēng)湯高劑量組、健脾柔肝息風(fēng)湯中劑量組、健脾柔肝息風(fēng)湯低劑量組，每組10只。除空白組腹腔注射生理鹽水3 mL/（kg·d）外，余5組腹腔注射亞氨基二丙腈150 mg/（kg·d），連續(xù)注射1周，則出現(xiàn)鼻嗅、仰頭、擺頭、軀體旋轉(zhuǎn)等興奮性增高、活動(dòng)增多的表現(xiàn)，按Diammond[6]評(píng)分方法評(píng)分≥1分可判定造模成功。

1.5? 干預(yù)措施

造模7 d后，空白組、模型組：灌胃給予等容量蒸餾水;氟哌啶醇組灌胃氟哌啶醇：0.5 mg/（kg·d）（氟哌啶醇配成混懸液，質(zhì)量濃度為1 mL含0.025 mg藥物）;健脾柔肝息風(fēng)湯高、中、低劑量組灌胃健脾柔肝息風(fēng)湯，按12、6、3 g/（kg·d）給藥，每日1次，連續(xù)灌胃6周。

1.6? 標(biāo)本采集與檢測(cè)

在末次給藥72 h后，斷頭取腦，冰上迅速剝離紋狀體，稱重后液氮速凍放入-80 ℃冰箱保存待測(cè)。使用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)腦組織DA、HVA含量，嚴(yán)格參照試劑盒說明操作。將各種試劑移至室溫（18～25 ℃）平衡至少30min，按前述方法配制試劑，備用。加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣本孔，每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本100 μL，輕輕晃動(dòng)混勻，覆上板貼，置37 ℃溫育2 h。棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，覆上新的板貼，置37 ℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，覆上新的板貼，置37 ℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色15～30 min。依序每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。在反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測(cè)量各孔的OD值，以O(shè)D值除以蛋白濃度所得的值表示DA、HVA的含量。

1.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件包，計(jì)量資料以“x±s”表示，多組間比較，方差齊性，則采用單因素方差分析，方差不齊，則采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

健脾柔肝息風(fēng)湯對(duì)TD模型大鼠腦組織中多巴胺及高香草酸的含量影響：與模型組比較，健脾柔肝息風(fēng)湯各組DA及HVA含量均有升高（P<0.01）;氟哌啶醇組與健脾柔肝息風(fēng)湯中、低劑量組比較DA及HVA含量均升高（P<0.05）;氟哌啶醇組與健脾柔肝息風(fēng)湯高劑量組比較DA及HVA含量相當(dāng)（P>0.05）。結(jié)果見表1。

3 討論

DA是腦內(nèi)重要神經(jīng)遞質(zhì)，在控制行為和認(rèn)知功能中具有重要作用[7]，異常的DA信號(hào)具有干擾前額葉皮質(zhì)和紋狀體環(huán)路的作用，長期的DA異常調(diào)節(jié)，可以導(dǎo)致兩者功能紊亂[8-9]。此外黑質(zhì)紋狀體通路，它的纖維投射起自中腦黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元，支配背側(cè)紋狀體（尾殼核），此通路為椎體外系的一個(gè)重要部分，它涉及運(yùn)動(dòng)的控制，是調(diào)節(jié)行為活動(dòng)反應(yīng)的基本結(jié)構(gòu)，長期的DA異常調(diào)節(jié)，可以導(dǎo)致精神活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)功能紊亂。而HVA是DA在降解酶的作用下產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物，通常被視為DA活性的主要指標(biāo)[10]。有研究表明TD患兒血清及腦脊液中HVA較正常對(duì)照組有明顯變化，佐證DA系統(tǒng)活性與TD發(fā)病具有關(guān)聯(lián)性[11-12]，因此HVA可作為直接反應(yīng)腦內(nèi)DA代謝的標(biāo)志。故DA及代謝產(chǎn)物HVA平衡失調(diào)均可能導(dǎo)致抽動(dòng)障礙的發(fā)生。

本文建立抽動(dòng)障礙大鼠模型（有相關(guān)文章及實(shí)驗(yàn)表明，抽動(dòng)障礙老鼠選擇大鼠及小鼠均可[4-5]），研究發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組DA及HVA含量均降低;與模型組比較，氟哌啶醇組DA及HVA含量升高;與模型組比較，健脾柔肝息風(fēng)湯高、中、低劑量組DA及HVA含量均升高;氟哌啶醇是多巴胺受體拮抗劑，是治療抽動(dòng)障礙的主要藥物，通過此實(shí)驗(yàn)說明健脾柔肝息風(fēng)湯在治療抽動(dòng)障礙時(shí)，通過調(diào)節(jié)DA能系統(tǒng)及代謝產(chǎn)物平衡而起到相關(guān)作用。

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，TD多與肝脾功能失調(diào)有關(guān)，常表現(xiàn)為肝亢脾虛的特點(diǎn)。導(dǎo)師張滌教授從五行生克制化理論入手，根據(jù)肝風(fēng)亢盛、脾虛夾痰的病理演變規(guī)律，提出本病病機(jī)為木亢土虛，肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，治療以“抑木扶土”法為綱，總結(jié)出“健脾柔肝息風(fēng)湯”以平肝息風(fēng)、健脾化痰。方中白芍柔肝、鉤藤平肝為君藥。白芍味苦、酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)，具有柔肝斂陰、平抑肝陽的功效，其主要有效成分白芍總苷具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、解痙作用[13-14]。鉤藤味甘、苦，性涼，具有平肝息風(fēng)的功效，現(xiàn)代臨床中用于高熱驚厥，驚癇抽搐等疾病中[15]，中藥藥理研究表明，鉤藤及鉤藤堿能明顯降低大腦皮層的興奮性，具有顯著的抗驚厥、抗癲癇、保護(hù)神經(jīng)元等作用[16-17]。茯苓健脾益氣，僵蠶、全蝎善于驅(qū)風(fēng)，三者共為臣藥。茯苓味甘、淡，性平，入脾、心、腎經(jīng)，具有健脾化痰，益氣寧心的功效，臨床中有改善學(xué)習(xí)記憶、鎮(zhèn)靜的作用[18]。僵蠶味辛、咸，性平，入肝、心、脾、肺經(jīng)，具有息風(fēng)止痙、活絡(luò)通經(jīng)等功能。現(xiàn)代研究表明僵蠶表面含有的草酸銨是其主要藥理成分，具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用[19]。全蝎具有息風(fēng)、鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛等作用，全蝎蝎毒的主要成分是抗癲癇肽，其作用依賴于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的存在，藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)全蝎醇提物有鎮(zhèn)靜作用[20]。甘草為使藥，具有補(bǔ)益脾氣，調(diào)和諸藥的功效，具有提高免疫力的作用[21]。通過本次研究，發(fā)現(xiàn)健脾柔肝息風(fēng)湯對(duì)TD大鼠模型腦組織中DA和HVA有調(diào)節(jié)平衡的作用，從而抑制抽動(dòng)的發(fā)生，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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