張海韻 嚴禮 肖穩(wěn)

摘要：沙門氏菌是一種食源性致病菌，能夠引起腸胃炎、腹瀉以及疼痛。傳統(tǒng)的檢測技術需經(jīng)過預增菌以及生化試驗、血清學試驗等一系列復雜繁瑣的操作，檢驗周期長、檢驗效率較低。本研究通過合成一種羧甲基殼聚糖一分子信標一金納米材料，采用一種新的基于分子信標共價功能化的殼聚糖技術和金納米團聚比色的方法對含SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌沙門氏菌進行檢測。結果顯示：這種方法具有較好的靈敏度和特異度。

關鍵詞：鼠傷寒沙門氏菌;適配體;生物傳感器

一、實驗方法

1.生物傳感器的合成。

向30mg/mL的羧甲基殼聚糖溶液中加入NHS 0.17g，攪拌15min，然后在2℃冰水浴攪拌器中，緩慢滴入1-乙基-3-（二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）的水溶液。lOmin滴加完成后，仍在冰水浴下繼續(xù)攪拌反應th，使羧甲基殼聚糖的羧基充分活化。取1mL自制納米金溶液于EP管中，4℃、10000r/mm離心10min，棄上清，重懸。向納米金溶液中加入配好的羧甲基殼聚糖一適配體復合物100 μL，混勻，置于37℃搖床中孵育30h。為除去可能過量的適配體，將上述混合液在4℃、10000r/min離心10min，棄上清，最終得到羧甲基殼聚糖一適配體一納米金材料，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.靶標DNA的檢測。

羧甲基殼聚糖一分子信標一金納米復合物100 μL，加入靶標DNA，使靶標DNA終濃度為0.5 0nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L、500nmol/L，于37℃孵育30min。加入1.5mol/L的NaCl溶液使釋放出的金納米顆粒團聚，觀察溶液，若有顏色變化（紅變藍），則實驗可行。用紫外可見分光光度計檢測最大吸收波長（520nm左右）的吸光度A值，進行定量測定。

3.特異性試驗。

將鼠傷寒沙門氏菌在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基于95℃水浴15min，置冰上10min以獲取相應的ssDNA，加入100 μ L配好的羧甲基殼聚糖一分子信標一金納米復合物，于37℃搖床孵育1h。加入1.50mol/L的氯化鈉溶液，混勻，觀察溶液顏色變化，用紫外分光光度計檢測520nm的吸光度A值。另外取金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、單核細胞增生李斯特菌（5×107CFU/mL）的DNA，在相同的條件下進行樣品檢測以證明該方法對于鼠傷寒沙門氏菌的特異性。

二、結果

1.靶標DNA的檢測。

不同濃度的靶標DNA檢測結果如圖1所示，隨著靶標DNA濃度的增加，溶液的吸光度值也不斷增加，在靶標DNA濃度為0.05μmol/L-0.5μmol/L的范圍內(nèi)與吸光度值呈線性關系，表明該方法在一定范圍內(nèi)可以對靶標DNA進行定量檢測，按照3 S/K計算出該方法對靶標DNA的檢測下限為50nmol/L。

取不同類別的細菌在相同的條件下進行檢測，檢測結果如圖2所示，加入鼠傷寒沙門氏菌的吸光度值遠遠大于其他三種細菌，因此表明了只有含有SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌才能使靶標DNA分子信標解崩釋放出金納米粒子，從而產(chǎn)生顯色反應，從而說明該檢測方法對于鼠傷寒沙門氏菌具有較強的特異性。

本研究設計了一種新穎的、快速的基于分子信標共價功能化的殼聚糖技術和金納米團聚比色的生物傳感器用于檢測鼠傷寒沙門氏菌，該傳感器用于檢測含有SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌，其檢測下限可以達到50nmol/L，并且在DNA濃度為0.05μmol/L-0.5μmol/L的范圍內(nèi)具有良好的線性關系，并且該種檢測方法具有較好的選擇性和特異性。