劉美辰　路宏博　趙小旭等

[摘要]本研究建立了快速定量檢測(cè)糙米中重金屬離子鉛的膠體金免疫層析試紙條分析方法。通過一系列的實(shí)驗(yàn)研究了該方法的靈敏度、重復(fù)性和特異性。結(jié)果表明用免疫膠體金法測(cè)定糙米中鉛的檢出限為0.041mg/kg，定量限為0.097mg/kg，方法重現(xiàn)性較好，使用膠體金免疫層析法和原子吸收光譜法同時(shí)檢測(cè)加標(biāo)樣品，結(jié)果一致。因此，該方法適用于糙米中重金屬離子鉛的快速定量檢測(cè)。

[關(guān)鍵詞]鉛；膠體金免疫層析法；乳制品

中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180213

在自然情況下，土壤中重金屬含量較低，一般情況下不會(huì)對(duì)人體及生態(tài)環(huán)境造成很大的危害。但是，隨著我國(guó)工業(yè)的發(fā)展，固體廢棄物不斷增加，河流污染嚴(yán)重，同時(shí)農(nóng)業(yè)化肥和農(nóng)藥的大量使用也加劇了重金屬在土壤中的大量累積。目前我國(guó)耕地重金屬污染嚴(yán)重，被污染的耕地面積也在不斷增加。鉛是受污染糧食中的有毒重金屬之一，對(duì)人的神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓造血機(jī)能、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等都有明顯毒害作用且具有積累性，重金屬鉛能與人體中多種酶結(jié)合進(jìn)而干擾人體多方面的生理活動(dòng)。當(dāng)人體中鉛含量升高時(shí)，會(huì)破壞血紅蛋白的合成，造成貧血、血壓增高、腎損傷，造成孕婦流產(chǎn)和墮胎，破壞神經(jīng)中樞，影響腦發(fā)育、影響生育能力，造成小孩發(fā)育遲緩和行為沖動(dòng)。糧食作為人們飲食的主要食物來源，其安全性對(duì)于國(guó)民的健康至關(guān)重要。

目前常見的重金屬離子鉛的檢測(cè)方法主要是石墨爐原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等，這些方法需要費(fèi)用高昂的大型儀器設(shè)備、專門的實(shí)驗(yàn)室、專業(yè)的操作技術(shù)人員和復(fù)雜的樣品前處理過程，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩選檢測(cè)。

目前檢測(cè)重金屬鉛的方法多為儀器法，利用膠體金免疫層析法檢測(cè)重金屬離子鉛較少，因此本文基于膠體金免疫層析技術(shù)，檢測(cè)主要的糧食類別之一：糙米中重金屬鉛的含量具有必要性，并且對(duì)于糧庫等機(jī)構(gòu)來說具有實(shí)際意義。

1材料與方法

1.1主要儀器

干式加熱器（HMG-GS北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）、膠體金讀數(shù)儀（BMZ 6000北京美正生物科技有限公司）、200μL移液器（賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司）、計(jì)時(shí)器（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）、離心管（50mL，20mL，潔特）、槍頭（BIOFIL）、一次性手套（麥迪康）、離心機(jī)（DM0412大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司）、原子吸收光譜儀（PinAAcle 900T perkinelmer公司）、渦旋混合器（TZL-5013蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、分析天平（PL-602E梅特勒一托利多分析天平），20目篩網(wǎng)。

1.2主要試劑

超純水、硝酸、硫酸、EDTA、乙酸乙酯、甲醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉等。

1.3方法

1.3.1檢測(cè)原理

重金屬鉛檢測(cè)試紙條應(yīng)用了競(jìng)爭(zhēng)抑制膠體金免疫層析的原理（結(jié)構(gòu)如圖1所示）。將金標(biāo)抗體結(jié)合在金標(biāo)墊/微孔中，將抗原（T線）和二抗（C線）固定于NC膜上，當(dāng)待測(cè)樣品加到樣品墊/微孔中后，樣本中抗原與金標(biāo)抗體結(jié)合，通過層析作用向前移動(dòng)。當(dāng)移至（T線）區(qū)域時(shí)，偶聯(lián)抗原和未結(jié)合金標(biāo)抗體結(jié)合而被截留，聚集在檢測(cè)線（T線）上，剩余金標(biāo)抗體越過檢測(cè)線（T線），在質(zhì)控線（C線）處與二抗結(jié)合顯色。配合儀器讀取結(jié)果如圖1所示。

1.3.2檢測(cè)方法

1.3.2.1樣品前處理

稱取2.0g±0.02g均質(zhì)（過20目篩網(wǎng)）樣本于50mL離心管中，加入6mL硝酸溶液（0.5M）和4mL乙酸乙酯，具塞，充分振蕩5min后，4 000rpm離心5min；取1mL上清，加入2mL硫酸溶液（1M），振蕩3min，4 000rpm離心3min；棄上清，取500μL下清，立即加入0.5M PBS溶液（5min內(nèi)），振蕩混勻；取250μL該混合液，加入200μL EDTA-水溶液（0.5M），振蕩均勻，1min內(nèi)待檢。

1.3.2.2檢測(cè)步驟

（1）在進(jìn)行檢測(cè)前先完整閱讀使用說明書，從原包裝中取出試劑桶，打開后取出所需數(shù)量的微孔試劑和試紙條，并做好標(biāo)記；微孔試劑取出后，請(qǐng)立即蓋好試劑桶蓋。

（2）使用前將試紙條、微孔試劑和待檢樣品恢復(fù)至室溫25℃；將所需微孔試劑置于加熱器上的微孔中。一次檢測(cè)樣品數(shù)量不要超過4個(gè)；如果一次檢測(cè)樣品數(shù)量超過4個(gè)，請(qǐng)按照4個(gè)一組，分批檢測(cè)。

（3）用微量移液器移取200μL回溫后的樣品于微孔試中，緩慢抽吸至檢測(cè)樣品與微孔試劑充分混勻；使用計(jì)時(shí)器，開始計(jì)時(shí)。

（4）40℃條件下孵育5min；孵育結(jié)束后，停止計(jì)時(shí)；從試劑桶中取出所需數(shù)量的試紙條并插入微孔試劑中，使印有LOGO手柄端向上，另一端向下并充分浸入溶液中；再次按下計(jì)時(shí)器，開始第二次5min孵育。

（5）第二次5min孵育結(jié)束后，停止計(jì)時(shí)；取出試紙條，擦除下端樣品墊，立即使用讀數(shù)儀讀取檢測(cè)結(jié)果。注意不要接觸或損壞測(cè)試條中部檢測(cè)區(qū)域，并在1min內(nèi)讀取結(jié)果。

（6）檢驗(yàn)完畢，剩余試紙條和微孔試劑放回試劑桶并蓋緊桶蓋，剩余所有的試劑蓋緊瓶蓋，一起放回試劑盒中，2～8℃保存。

1.3.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

稱取陰性樣品，每份2g，然后加入重金屬鉛標(biāo)準(zhǔn)品，添加鉛含量在0μg/kg，20μg/kg，50μg/kg，100μg/kg，200μg/kg，400μg/kg。每個(gè)濃度三份平行。然后其余步驟同1.3.2.2，以T線灰度值作為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的樣品中鉛添加濃度值為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.4方法檢出限及定量限

稱取20份陰性樣本，每份2g，根據(jù)步驟1.3.2.1和1.3.2.2進(jìn)行檢測(cè)，該方法檢出限LOD以陰性樣品20次測(cè)定結(jié)果的均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，定量限LOQ以空白樣品20次測(cè)定結(jié)果的均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算。

1.3.2.5準(zhǔn)確性

利用膠體金分析法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法分別對(duì)8個(gè)糙米樣品進(jìn)行雙試驗(yàn)檢測(cè)，采用配對(duì)t檢驗(yàn)法比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果是否存在顯著性差異。

1.3.2.6重復(fù)性

選取中等水平糙米樣品，重復(fù)測(cè)定8次，按照GB/T 4889-2008《數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和解釋正態(tài)分布均值和方差的估計(jì)與檢驗(yàn)》中7.1單總體方差或標(biāo)準(zhǔn)差檢驗(yàn)實(shí)施x2分布檢驗(yàn)，判斷該方法重復(fù)性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)差是否超過標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求，同時(shí)采用8次測(cè)定極差與現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的8次測(cè)定重復(fù)性臨界極差進(jìn)行對(duì)照，考察該方法的重復(fù)性。

2結(jié)果分析

2.1結(jié)果判定

（1）打開樣品卡殼，將定量試紙條插入樣品卡殼槽內(nèi)，保證白色NC膜表面的兩條色帶在卡殼視窗中間。

（2）將樣品卡殼插入讀數(shù)儀樣品卡槽中，按照儀器操作程序，點(diǎn)擊觸屏“檢測(cè)”鍵或“TEST”按鈕，讀取結(jié)果。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將糙米的前處理液按照1.3.2.2用膠體金試紙條進(jìn)行檢測(cè)并用膠體金讀數(shù)儀掃描，以掃描檢測(cè)線的灰度值為縱坐標(biāo)，以添加后的鉛濃度值（mg/kg）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。

2.3方法的檢出限和定量限

通過對(duì)20個(gè)獨(dú)立的陰性樣品進(jìn)行測(cè)定，該方法的檢出限LOD結(jié)果為0.041mg/kg，定量限LOQ結(jié)果為0.097mg/kg，具體的檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

2.4準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)

分別采用膠體金試紙法和儀器法對(duì)8個(gè)已知濃度的樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可知，膠體金試紙法和儀器法的檢測(cè)結(jié)果不存在顯著性差異。

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按照步驟1.3.2.1和1.3.2.2進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表3所示，通過檢測(cè)結(jié)果計(jì)算得出，檢測(cè)結(jié)果平均值為0.125mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差s=0.013mg/kg，極差=0.043mg/kg；根據(jù)GB 5009.12-2017規(guī)定：在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算數(shù)平均值的20%，則兩次測(cè)定絕對(duì)差（即重復(fù)性限r(nóng)）≤0.025，8次測(cè)定的重復(fù)性臨界極差ERR95（8）=F（8）*r/2.8=0.038，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Sr=r/2.8=0.008 9。顯著性水平a=0.05情況下，查表得x20.95（7）=14.067，x2=（n-1）s2/sr2=15.86>x20.95（7），極差0.043>重復(fù)性臨界極差ERR95（8），檢測(cè)結(jié)果表明該方法測(cè)定的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差和極差均超過標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求。

2.6注意事項(xiàng)

（1）檢測(cè)試紙條請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用，使用前將試紙條和待檢樣本恢復(fù)至室溫。

（2）樣本大米和糙米可共用一條曲線，即糙米樣本也可用大米的曲線進(jìn)行檢測(cè)。

（3）所有溶液使用前需搖勻，試劑C會(huì)有沉淀出現(xiàn)，但不影響結(jié)果。

（4）試劑A具有微弱的揮發(fā)性，建議佩戴口罩或在通風(fēng)櫥中操作。

（5）樣本在振蕩完，移取1.8mL上清時(shí)，偶爾會(huì)有顆粒物堵塞槍頭的情況發(fā)生，可吹出、重新吸取。

（6）偶有樣本因顆粒度過細(xì)等出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，造成上清取液量不足，則“方法二”中第一步振蕩5min后，可以靜置10min后再離心，也可適當(dāng)增加離心時(shí)間至8～10min。

（7）檢測(cè)過程中請(qǐng)勿觸摸試紙條中央的白色膜面，如不小心接觸后請(qǐng)遺棄。

（8）槍頭與離心管等耗材不可混用，以免交叉污染。

（9）樣品要與微孔中試劑充分混合均勻，避免產(chǎn)生泡沫。

（10）第二次孵育后，務(wù)必立即去掉測(cè)試條下端的樣品墊，并在1min內(nèi)讀取結(jié)果，因?yàn)樵嚰垪l干燥后顏色深度會(huì)產(chǎn)生一定變化，影響最后的結(jié)果。

（11）儀器讀取結(jié)果必須使用配套讀數(shù)儀和樣品卡槽。

（12）試劑從試劑桶取出后，請(qǐng)立即蓋好試劑桶蓋。用完一桶試劑再打開另外一桶，如果一次用不完8個(gè)微孔，可取用所需數(shù)量的微孔，將剩余微孔立即放回到裝有干燥劑的試劑桶中密封保存。請(qǐng)小心開啟微孔蓋，以保證全部試劑保留在微孔中。

（13）如發(fā)現(xiàn)陽性，檢測(cè)結(jié)果需要使用法定的確證方法進(jìn)行確證。

（14）試驗(yàn)遇到的任何問題，請(qǐng)與供應(yīng)商聯(lián)系。

3結(jié)論

通過一系列性能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，重金屬離子鉛膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)時(shí)間在15min內(nèi)，檢出限為0.041mg/kg，定量限為0.097mg/kg。該方法重復(fù)性良好，檢測(cè)結(jié)果與儀器法檢測(cè)結(jié)果一致，方法簡(jiǎn)便，對(duì)人員專業(yè)技能要求較低，并且其靈敏度、穩(wěn)定性和特異性等均達(dá)到了食品中有毒有害物質(zhì)快速檢測(cè)的要求，非常適用于糧庫收購(gòu)環(huán)節(jié)的篩選工作。