王鵬良 楊利平 吳紅英 農(nóng)有良 吳雙成 肖玉菲 覃子海 王華宇 劉海龍

摘 要： 為了利用葉綠體基因工程技術(shù)改良普通油茶的重要經(jīng)濟(jì)性狀，該研究以普通油茶葉綠體全基因組序列為材料，從中篩選出51條長(zhǎng)度大于300 bp且以ATG起始的非重復(fù)CDS （Coding DNA Sequence）為對(duì)象，利用CodonW軟件分析其密碼子偏好性。結(jié)果表明：密碼子第三位GC含量為27.55%，ENC范圍在35.23～56.67之間，平均值為46.09；RSCU值大于1.00的密碼子數(shù)目為30個(gè)，其中29個(gè)第三位堿基以U或A結(jié)尾；中性繪圖表明GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)為0.143，相關(guān)性不顯著，回歸系數(shù)為0.0573；頻數(shù)分布顯示，55%基因的ENC比值集中分布在0～0.1，25%基因的ENC比值分布在0.1～0.2之間；對(duì)應(yīng)分析結(jié)果表明，第一向量軸占10.12%的差異，第二向量軸占9.36%的差異，其余兩軸分別占7.97%和7.46%，前4軸累計(jì)差異為34.91%。中性繪圖、ENC-plot和對(duì)應(yīng)性分析均表明普通油茶葉綠體基因密碼子偏好受突變作用，更多受選擇的影響。最終取高表達(dá)優(yōu)越密碼子和高頻密碼子共有的CUU、AUU、GUU、GUA、UAA、CAA、AAA、GAC、GAA、CCU、ACU、GCU、GCA、UGU、CGU、AGU、UUG、GGU等18個(gè)密碼子作為最優(yōu)密碼子。該研究結(jié)果為利用葉綠體基因工程技術(shù)改良普通油茶重要經(jīng)濟(jì)性狀奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 普通油茶， 葉綠體， 密碼子偏好， ENC， RSCU

中圖分類號(hào)： Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1000-3142（2018）02-0135-10

Condon preference of chloroplast genome in Camellia oleifera

WANG Pengliang1，3*， YANG Liping2， WU Hongying2， NONG Youliang1， WU Shuangcheng1， XIAO Yufei3， QIN Zihai3， WANG Huayu1，2， LIU Hailong3

（ 1. Guangxi Key Laboratory of Beibu Gulf Marine Biodiversity Conservation， Qinzhou University， Qinzhou 535011， Guangxi， China； 2. Qinzhou Key Laboratory of Plant Biotechnology， Qinzhou Forestry Science Insititute， Qinzhou 535099， Guangxi， China； 3. Guangxi Key Laboratory of Special Non-Wood Forest Cultivation and Utilization， Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Science Institute， Nanning 530002， China ）

Abstract： With the rapid development of the industry and increase of planting area of Camellia oleifera， the harvest was still affected by the factors such as the tolerance of disease， insect and drought as well as mating compatibility. Genetic engineering of chloroplast was an effective way to improve the important traits of plant. In order to improve the important traits of C. oleifera， it was necessary to carry out the analysis on codon preference of its chloroplast genome. The whole genome sequence of chloroplast in C. oleifera taken as raw material， 51 CDS who were longer than 300 bps， started with ATG and not repeated were screened for future analysis. The codon preference was conducted by the CodonW software. The results indicated that the GC content of the third base of genetic code was 27.55% and effective number of codons ranged from 35.23 to 56.67 with an average of 46.09 and then 29 codons of 30 whose RSCU were more than 1 ended with A or U. Neutral plot analysis showed the correlation between GC12 and GC3 was not significant and the coefficient of correlation and regression was 0.143 and 0.057 3， respectively. Frequency analysis showed 55% and 25% of the ENC ratio of genes focused on the region of 0-0.1 and 0.1-0.2. Correspondence analysis indicated the first axis accounted for 10.12 variation and the rested three axises accounted for 9.36%， 7.97% and 7.46% and the first four axises accounted for 34.91% in total. All the methods used in this study showed that codon preference was affected by not only mutation and but also selection. Finally the 18 optimal codons including CUU， AUU， GUU， GUA， UAA， CAA， AAA， GAC， GAA， CCU， ACU， GCU， GCA， UGU， CGU， AGU， UUG， GGU were determined. This work provides plenty of information for improving important traits of C. oleifera utilizing the genetic engineering of chloroplast.

Key words： Camellia oleifera， chloroplast， codon preference， effective number of codon， relative synonymous codon usage

普通油茶（Camellia oleifera）是山茶科（Theacae）山茶屬（Camellia）一類植物，是我國(guó)南方最重要的木本食用植油料物種之一（張恩慧等， 2016）。目前，油茶最具價(jià)值的部分為油茶果。茶籽油富含多種對(duì)人體健康有益的成分，對(duì)于提高人體的健康水平有很大影響，尤其是在人體免疫力和預(yù)防高血壓等方面，因此是一種非常優(yōu)質(zhì)的食用油，被譽(yù)為“東方的橄欖油”；同時(shí)茶籽油還含有多種有益于皮膚的成分，易于吸收，無(wú)刺激性，所以常被用于調(diào)制藥膏和高級(jí)化妝品的用油（莊瑞林， 2007）；其果殼由木質(zhì)素、半纖維素和纖維素組成，可以用來(lái)制作糠醛、木糖醇、培養(yǎng)基、活性炭等；茶籽粕可以直接用于制作肥料及提取茶皂素、鞣質(zhì)（單寧）、黃酮、生物堿等生物活性物質(zhì)。

當(dāng)前由于我國(guó)人口規(guī)模增長(zhǎng)和居民收入水平提高，我國(guó)食用植物油消費(fèi)總量快速增長(zhǎng)，盡管近年來(lái)植物油生產(chǎn)穩(wěn)步增長(zhǎng)，然而消費(fèi)增速高于生產(chǎn)增速，缺口仍然較大（張?chǎng)悾?2016）。國(guó)家主動(dòng)調(diào)整油料物種產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，由于油茶油質(zhì)好、生長(zhǎng)快、壽命長(zhǎng)、適應(yīng)性強(qiáng)、不占用耕地等優(yōu)點(diǎn)，油茶產(chǎn)業(yè)得到重視，油茶產(chǎn)業(yè)獲得快速發(fā)展，新品種數(shù)量增加，推廣面積持續(xù)擴(kuò)大。到目前為止，全國(guó)油茶種植面積約為426.67萬(wàn)hm2（羅晨，2016）。

油茶產(chǎn)量持續(xù)增長(zhǎng)，但油茶生產(chǎn)中還會(huì)遇到以下問(wèn)題：首先，近年來(lái)大面積油茶病害的發(fā)生，如炭疽病，軟腐病和葉腫病（徐麗萍和檀根甲， 2015）；其次，大規(guī)模蟲害的出現(xiàn)，如蚧殼蟲，象鼻蟲等；第三，由于油茶的抗旱性弱導(dǎo)致低齡油茶植株死亡率高，引起油茶落花、落果，降低產(chǎn)量（左繼林等， 2012； 陳永忠等， 2014）；最后，油茶的交配親和性也嚴(yán)重影響了油茶的產(chǎn)量（常維霞和姚小華， 2016； 常維霞等， 2016）。

基因工程技術(shù)是改良植物重要性狀的有效手段 （王關(guān)林和方宏筠， 2014）。葉綠體基因組是理想的轉(zhuǎn)化載體，高表達(dá)優(yōu)勢(shì)明顯，同時(shí)能將轉(zhuǎn)化基因的擴(kuò)散控制在最低程度（Daniell & Chase， 2004）。葉綠體基因組中存在密碼子偏好，而且不同物種間密碼子偏好差異顯著（Morton， 1999； Liu & Xue， 2005）。為了更好地設(shè)計(jì)葉綠體高效表達(dá)載體，進(jìn)一步利用葉綠體基因工程技術(shù)改良油茶重要性狀，有效降低油茶產(chǎn)量損失，分析普通油茶葉綠體基因組密碼子偏好十分必要。

1 材料與方法

1.1 序列材料

根據(jù)已報(bào)道的葉綠體基因組的GenBank登錄號(hào)NC_023084.1（Shi et al， 2013），登陸NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），搜索并下載完整普通油茶葉綠體基因組序列及其CDS（Coding DNA Sequence），序列總長(zhǎng)度為156 971 bp，共包含87條編碼蛋白的CDS。由于短序列無(wú)法正確計(jì)算有效密碼子數(shù) （Wright， 1990），為了減少樣本誤差，本研究選擇以ATG為起始密碼子的非重復(fù)且長(zhǎng)度大于300 bp的序列進(jìn)行分析。

1.2 方法

1.2.1 密碼子偏好參數(shù)計(jì)算 以選取的CDS為研究對(duì)象，使用CodonW 1.4.2軟件和在線程序CUSP（http：//imed.med.ucm.es/EMBOSS/）分析密碼子使用偏好參數(shù)，即有效密碼子數(shù)（Effective Number of Codon， ENC）、相對(duì)同義密碼子使用度（Relative Synonymous Codon Usage， RSCU）、GC、GC1、GC2、GC3、GC3s。其中，GC、GC1、GC2、GC3分別代表了基因CDS序列的GC總含量和密碼子的對(duì)應(yīng)位置上的GC含量，GC3s為同義密碼子第三位的GC含量。

1.2.2 中性繪圖分析 中性繪圖是一種可初步判斷影響密碼子使用偏好因素的方法。首先計(jì)算密碼子GC1和GC2的平均值GC12，再以計(jì)算出的平均值為縱坐標(biāo)，以GC3為橫坐標(biāo)作散點(diǎn)圖，圖中每一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)基因的位置。由中性繪圖可分析密碼子的前兩位堿基和第三位堿基的關(guān)系，從而判斷密碼子使用偏好由突變或選擇造成。

1.2.3 ENC-plot繪圖 以GC3為橫坐標(biāo)，ENC為縱坐標(biāo)，構(gòu)建二維散點(diǎn)圖，并在圖中構(gòu)建出ENC值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)基因點(diǎn)分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線附近，這代表密碼子偏好性只是受到了突變作用的影響，如果各基因點(diǎn)集中在預(yù)期曲線下方，表明密碼子偏好更多受選擇影響。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式如下（Wright， 1990）：

ENC=2+GC3+29GC23+（1-GC3）2

1.2.4 對(duì)應(yīng)性分析 對(duì)應(yīng)性分析是一種利用多元統(tǒng)計(jì)探究不同基因密碼子變異趨勢(shì)的方法。利用CodonW軟件的RSCU對(duì)應(yīng)分析功能，將所有基因分布到59維向量空間，從而反映出密碼子使用偏好特點(diǎn)。通過(guò)分析基因位置探究基因向量及基因間的值的變異程度，推測(cè)導(dǎo)致密碼子偏好發(fā)生的原因。

1.2.5 最優(yōu)密碼子確定 以ENC偏好性為標(biāo)準(zhǔn)排序，兩端各選出10%基因，分別建立高低偏性庫(kù)，取兩庫(kù)中ΔRSCU>0.08的密碼子作為高表達(dá)優(yōu)越密碼子（楊惠娟等， 2012； 楊國(guó)鋒等， 2015）。將高表達(dá)優(yōu)越密碼子與高頻密碼子相比較，確定出最優(yōu)密碼子（劉慶坡和薛慶中， 2004； 續(xù)晨等， 2010； 羅洪等， 2015； 胡莎莎等， 2016）。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子組成分析

根據(jù)密碼子使用偏好分析要求，本文篩選到51條CDS，再利用CodonW軟件和CUSP程序?qū)Y選出的CDS進(jìn)行分析。表1結(jié)果表明，密碼子第一位的GC平均含量為46.86%、第二位為39.28%、第三位為27.55%，第三位的GC含量明顯小于前兩位的GC含量，而且相差較大，說(shuō)明普通油茶葉綠體基因密碼子偏好于A和U結(jié)尾。 ENC范圍在35.23～56.67之間，平均值為46.09。ENC值小于35說(shuō)明密碼子偏性強(qiáng)，高于35則說(shuō)明偏性比較弱的標(biāo)準(zhǔn)（Jiang et al， 2008），說(shuō)明普通油茶葉綠體基因密碼子偏性較弱。

相關(guān)分析結(jié)果（表2）顯示，GC和GC1、GC2、GC3的相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平，其相關(guān)系數(shù)分別為0.829、0.766、0.379。GC1和GC2的相關(guān)性也達(dá)到了極顯著水平，其相關(guān)系數(shù)為0.445，但GC3與GC1，GC2的相關(guān)性均未達(dá)到顯著相關(guān)水平，說(shuō)明密碼子前兩位的GC含量比較相似，第三位GC含量和前兩位差異較大。ENC與GC3呈顯著相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.350，說(shuō)明第三位堿基的組成會(huì)對(duì)密碼子的使用偏性有影響。密碼子數(shù)目N與GC3、ENC顯著相關(guān)，表明基因序列長(zhǎng)度對(duì)GC3和密碼子的偏好性有一定的影響。

RSCU分析結(jié)果（表3）表明，RSCU值大于1.00的密碼子數(shù)目為30個(gè)。其中，16個(gè)第三位堿基為U；13個(gè)以A結(jié)尾；1個(gè)以G結(jié)尾。這說(shuō)明普通油茶葉綠體基因組密碼子偏愛以A或U（T）結(jié)尾，不偏好以G或C結(jié)尾的密碼子。

2.2 中性繪圖分析

普通油茶葉綠體基因中性繪圖分析（圖1）顯示， GC12的取值范圍為0.319 6～0.550 4， GC3的范圍為0.191 2～0.371 0。GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)為0.143，相關(guān)性未達(dá)到顯著水平，回歸系數(shù)為0.057 3，說(shuō)明GC12和GC3 的相關(guān)性微弱。突變對(duì)密碼子第一位、第二位和對(duì)第三位堿基組成的影響不同。各基因都落在對(duì)角線的上方，并且沒有對(duì)角線上或沿著對(duì)角線分布。突變不是密碼子偏性形成的主要原因。因此，普通油茶葉綠體基因密碼子的使用更多地受選擇的影響。

2.3 ENC-plot繪圖

以GC3為X軸，ENC為Y軸作圖（圖2），圖2中各點(diǎn)為基因分布情況。代表基因的各點(diǎn)基本都落在了標(biāo)準(zhǔn)曲線的下方。為了能更直接地顯示出

差異，根據(jù)ENCexp-ENCobsENCexp公式，計(jì)算ENC比值，再統(tǒng)計(jì)ENC比值的分布（表4）。頻數(shù)分布顯示，55%的基因的ENC比值集中分布在0～0.1，25%的基因ENC比值分布在0.1～0.2的區(qū)間，結(jié)果表明ENCexp與ENCobs有差異。假如ENCexp與ENCobs接近時(shí)，表明基因的密碼子受突變影響；本文中ENCexp與ENCobs有差異較大，所以普通油茶葉綠體基因組密碼子偏好更多受選擇的影響（胡莎莎等， 2016）。

2.4 對(duì)應(yīng)性分析

RSCU的對(duì)應(yīng)分析結(jié)果表明，第一向量軸占10.12%的差異，第二向量軸占9.36%的差異，其余兩軸分別為7.97%和7.46%，前4軸累計(jì)差異為34.91%，說(shuō)明第一軸對(duì)普通油茶葉綠體基因組密碼子偏好性造成的影響最大。第一軸與GC3的相關(guān)性為0.215和ENC的相關(guān)性為0.104，均相關(guān)不顯著。這說(shuō)明GC3是對(duì)普通油茶葉綠體基因組密碼子偏好性造成影響的不大，密碼子的偏好性受到其他多方面因素的影響。以Axis 1為橫坐標(biāo)，Axis 2為縱坐標(biāo)，從各基因在第一、第二軸的分布（圖3）看出，與遺傳結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因分布相對(duì)比較集中，說(shuō)明兩個(gè)類基因的密碼子使用是比較接近的；而其他類別基因可能是因?yàn)槊艽a子使用模式不同，分布比較分散。

2.5 最優(yōu)密碼子分析

以密碼子的有效數(shù)量ENC為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有基因的CDS序列進(jìn)行排序，先從排序結(jié)果的兩端各選取5個(gè)基因分別建立高表達(dá)基因庫(kù)和低表達(dá)基因庫(kù)；然后使用CodonW計(jì)算兩個(gè)表達(dá)庫(kù)中的RSCU值，并計(jì)算高低庫(kù)ΔRSCU值（表5）；最后確定22個(gè)密碼子（表中帶星號(hào)的）為普通油茶葉綠體基因組高表達(dá)優(yōu)越密碼子，10個(gè)以U結(jié)尾、6個(gè)以A結(jié)尾、5個(gè)以C結(jié)尾和1個(gè)以G結(jié)尾。

先將22個(gè)高表達(dá)優(yōu)越密碼子和表3得出的30個(gè)高頻密碼子相比較，然后選取共有的密碼子作為最優(yōu)密碼子，最后確定了18個(gè)密碼子為普通油茶葉綠體基因組最優(yōu)密碼子，分別為CUU、AUU、GUU、GUA、UAA、CAA、AAA、GAC、GAA、CCU、ACU、GCU、GCA、UGU、CGU、AGU、UUG、GGU，其中有2個(gè)密碼子以G或C結(jié)尾，其余的16個(gè)密碼子均以A或U結(jié)尾。

3 討論

在20種氨基酸中，除了甲硫氨酸和色氨酸只有單個(gè)密碼子外，其他18種氨基酸均有多種密碼子，即遺傳密碼子存在簡(jiǎn)并性。密碼子簡(jiǎn)并性常常表現(xiàn)在第三位密碼子上（朱圣庚和徐長(zhǎng)發(fā)， 2016），因此在普通油茶葉綠體基因組堿基組成中發(fā)現(xiàn)，GC1、GC2顯著相關(guān)，GC3與GC1、GC2相關(guān)不顯著，且GC3小于GC1和GC2，說(shuō)明普通油茶葉綠體基因組的堿基組成偏向于A和T，第3位密碼子通常以A、T結(jié)尾。這與多數(shù)植物，如文心蘭（李冬梅等， 2012）、甜蕎（羅洪等， 2015）、苦蕎（胡莎莎等， 2016）、蝴蝶蘭（續(xù)晨等， 2010）、蒺藜苜蓿（楊國(guó)鋒等， 2015）等物種的特點(diǎn)相一致。

突變和選擇是密碼子偏好形成的主要原因。ENC-plot分析結(jié)果表明，部分基因落點(diǎn)位于標(biāo)準(zhǔn)曲線附近，基因的實(shí)際ENC值與理論ENC值基本一致，說(shuō)明這些密碼子偏好受到GC含量（突變）的影響較大；而大多數(shù)基因的落點(diǎn)離標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)，實(shí)際ENC值與理論ENC值的差異較大，受選擇的影響較大。因此，普通油茶葉綠體密碼子偏好受到突變的影響，更多的是受到了選擇的作用。

中性繪圖和對(duì)應(yīng)性分析均支持普通油茶密碼偏好受突變和選擇共同作用。這與已報(bào)道的文心蘭（李冬梅等， 2012）、蝴蝶蘭（續(xù)晨等， 2010）、銀白楊（Zhou et al， 2008）、甜蕎（羅洪等， 2015）等有相似的結(jié)論；本文結(jié)果也印證了選擇對(duì)葉綠體密碼子使用起顯著影響（Morton， 1998）。

本研究采用由高表達(dá)優(yōu)越密碼子和高頻密碼子中選出兩者共有的密碼子，可以避免由于單方法存在問(wèn)題而導(dǎo)致結(jié)果出錯(cuò)，最終確定了CUU、AUU、GUU、GUA、UAA、CAA、AAA、GAC、GAA、CCU、ACU、GCU、GCA、UGU、CGU、AGU、UUG、GGU等18個(gè)密碼子為普通油茶葉綠體基因的最優(yōu)密碼子。在此基礎(chǔ)上可以通過(guò)對(duì)目的基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，提高該基因的表達(dá)效率，從而為改良普通油茶重要性狀奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

CHANG WX， YAO XH， 2016. Study onself-compatibility of Camellia oleifera clones [J]. For Res， 29（4）： 508-514. [常維霞，姚小華， 2016. 油茶無(wú)性系自交親和性分析 [J]. 林業(yè)科學(xué)研究，29（4）： 508-514.]

CHANG WX， YAO XH， LONG W， et al， 2016. Cross-compatibility of four kinds of Camellia species [J]. Bull Bot Res， 36（4）： 527-534. [常維霞，姚小華，龍偉，等，2016. 4個(gè)油茶物種雜交親和性分析 [J]. 植物研究，36（4）： 527-534.]

CHEN YZ， LUO J， CHEN LS， et al， 2014. Drought injury and countermeasure of Camellia oleifera in Hunan Province [J]. Nonwood For Res， 32（3）： 22-29. [陳永忠，羅健，陳隆升，等，2014. 湖南省油茶旱害及防治對(duì)策 [J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，32（3）： 22-29.]

DANIELL H， CHASE C， 2004. Molecular biology and biotechnology of plant organelles [M]. Dordrecht， Springer.

HU SS， LUO H， WU Q， et al， 2016. Analysis of codon bias of chloroplast genome of Fagopyrum tataricum [J]. Mol Plant Breed， 14（2）： 309-317. [胡莎莎，羅洪，吳琦，等，2016. 苦蕎葉綠體基因組密碼子偏愛性分析 [J]. 分子植物育種，14（2）： 309-317.]

JIANG Y， DENG F， WANG H， et al， 2008. An extensive analysis on the global codon usage pattern of baculoviruses [J]. Arch Virol， 153（12）： 2273-2282.

LI DM， L FB， ZHU GF， et al， 2012. Analysis on codon usage of chloroplast genome of Oncidium Gower Ramsey [J]. Guangdong Agric Sci， 10： 61-65. [李冬梅，呂復(fù)兵，朱根發(fā)，等，2012. 文心蘭葉綠體基因組密碼子使用的相關(guān)分析 [J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，10： 61-65.]

LIU Q， XUE Q， 2005. Comparative studies on codon usage pattern of chloroplasts and their host nuclear genes in four plant species [J]. J Gene， 84（1）： 55-62.

LIU QP， XUE QZ， 2004. Codon usage in the chloroplast genome of rice （Oryza sativa L. ssp. japonica） [J]. Acta Agronom Sin， 30（12）： 1220-1224. [劉慶坡，薛慶中，2004. 粳稻葉綠體基因組的密碼子用法 [J]. 作物學(xué)報(bào)，30（12）： 1220-1224.]

LUO C， 2016. The area of Camellia achieved 64 million acres [EB/OL]. WWW. cnfood. cn/n/2016/1219/98628. html. [羅晨， 2016. 全國(guó)油茶面積已達(dá)6400多萬(wàn)畝 [EB/OL]. WWW. cnfood. cn/n/2016/1219/98628. html.]

LUO H， HU SS， WU Q， et al， 2015. Analysis of buckwheat chloroplast gene codon bias [J]. Genomics Appl Biol， 34（11）： 2457-2464. [羅洪，胡莎莎，吳琦，等，2015. 甜蕎葉綠體基因密碼子偏愛性分析 [J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，34（11）： 2457-2464.]

MORTON BR， 1998. Selection on the codon bias of chloroplast and cyanelle genes in different plant and algal lineages [J]. J Mol Evol， 46（4）： 449-459.

MORTON BR， 1999. Strand asymmetry and codon usage bias in the chloroplast genome of Euglena gracilis [J]. Proc Nat Acad Sci USA， 96（9）： 5123-5128.

SHI C， LIU Y， HUANG H， et al， 2013. Contradiction between plastid gene transcription and function due to complex posttranscriptional splicing： An exemplary study of ycf15 function and evolution in angiosperms [J]. PLoS ONE， 8（3）： e59620.

WANG GL， FANG HY， 2014. Plant genetic engineering [M]. 2nd ed. Beijing： Science Press. [王關(guān)林，方宏筠， 2014. 植物基因工程 [M]. 第2版. 北京： 科學(xué)出版社.]

WRIGHT F， 1990. The ‘effective number of codons used in a gene [J]. Gene， 87（1）： 23-29.

XU LP， TAN GJ， 2015. Epidemic of Camellia oleifera diseases and their relations to the ecological conditions [J]. J Anhui Agric Univ， 42（2）： 272-275. [徐麗萍，檀根甲， 2015. 油茶主要病害流行與生態(tài)條件的關(guān)系和生態(tài)調(diào)控技術(shù) [J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，42（2）： 272-275.]

XU C， BEN AL， CAI XN， 2010. Analysis of synonymous codon usage in chloroplast genome of Phalaenopsis aphrodite subsp. formosana [J]. Mol Plant Breed， 8（5）： 945-950. [續(xù)晨，賁愛玲，蔡曉寧，2010. 蝴蝶蘭葉綠體基因組密碼子使用的相關(guān)分析 [J]. 分子植物育種，8（5）： 945-950.

YANG GF， SU KL， ZHAO YR， et al， 2015. Analysis of codon usage in the chloroplast genome of Medicago truncatula [J]. Acta Pratacul Sin， 171-179. [楊國(guó)鋒，蘇昆龍，趙怡然，等，2015. 蒺藜苜蓿葉綠體密碼子偏好性分析 [J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 24（12）： 171-179.]

YANG HJ， LIU GS， ZHANG ST， et al， 2012. Codon usage bias studies and cluster analysis on chloroplastic genes in tobacco [J]. Acta Tabac Sin， 18（2）： 37-43. [楊惠娟，劉國(guó)順，張松濤，等， 2012. 煙草葉綠體密碼子的偏好性及聚類分析 [J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，18（2）： 37-43.]

ZHANG EH， WANG XY， QIN ZH， et al， 2016. Genetic diversity analysis of Camellia oleifera in Guangxi using SSR markers [J]. Guihaia， 36（7）： 806-811. [張恩慧，王曉云，覃子海，等， 2016. 廣西普通油茶種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析 [J]. 廣西植物，36（7）： 806-811.]

ZHANG WL， 2016. Supply and demand of Chinas oilseeds and edible vegetable oil and their prospects during the 13th five-year plan period [J]. Agric Outlook， （2）： 4-8. [張?chǎng)悾?016. 中國(guó)油料及食用植物油供需形勢(shì)及“十三五”展望 [J]. 農(nóng)業(yè)展望，（2）： 4-8.]

ZHU SG， XU CF， 2016. Biochemistry [M]. 4th ed. Beijing： Higher Education Press. [朱圣庚，徐長(zhǎng)發(fā)，2016. 生物化學(xué) [M]. 第4版. 北京： 高等教育出版社.]

ZHUANG RL， 2007. Chinese oil tea [M]. 2nd ed. Beijing： Chinese Forestry Publishing House. [莊瑞林，2007. 中國(guó)油茶 [M]. 第2版. 北京： 中國(guó)林業(yè)出版社.]

ZHOU M， LONG W， LI X， 2008. Analysis of synonymous codon usage in chloroplast genome of Populus alba [J]. J For Res， 19（4）： 293-297.

ZUO JL， WANG YJ， GONG C， et al， 2012. Effects of different management measures on the fruit shape growth of high yield Camellia oleifera under during the summer drought period [J]. J Centr Southern Univ For & Technol， 32（4）： 15-20. [左繼林，王玉娟，龔春，等，2012. 高產(chǎn)油茶夏旱期不同經(jīng)營(yíng)措施對(duì)其果形生長(zhǎng)的影響 [J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，32（4）： 15-20.]