王鵬良 楊利平 吳紅英 農(nóng)有良 吳雙成 肖玉菲 覃子海 王華宇 劉海龍

摘 要： 為了利用葉綠體基因工程技術(shù)改良普通油茶的重要經(jīng)濟(jì)性狀，該研究以普通油茶葉綠體全基因組序列為材料，從中篩選出51條長度大于300 bp且以ATG起始的非重復(fù)CDS （Coding DNA Sequence）為對(duì)象，利用CodonW軟件分析其密碼子偏好性。結(jié)果表明：密碼子第三位GC含量為27.55%，ENC范圍在35.23～56.67之間，平均值為46.09；RSCU值大于1.00的密碼子數(shù)目為30個(gè)，其中29個(gè)第三位堿基以U或A結(jié)尾；中性繪圖表明GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)為0.143，相關(guān)性不顯著，回歸系數(shù)為0.0573；頻數(shù)分布顯示，55%基因的ENC比值集中分布在0～0.1，25%基因的ENC比值分布在0.1～0.2之間；對(duì)應(yīng)分析結(jié)果表明，第一向量軸占10.12%的差異，第二向量軸占9.36%的差異，其余兩軸分別占7.97%和7.46%，前4軸累計(jì)差異為34.91%。中性繪圖、ENC-plot和對(duì)應(yīng)性分析均表明普通油茶葉綠體基因密碼子偏好受突變作用，更多受選擇的影響。最終取高表達(dá)優(yōu)越密碼子和高頻密碼子共有的CUU、AUU、GUU、GUA、UAA、CAA、AAA、GAC、GAA、CCU、ACU、GCU、GCA、UGU、CGU、AGU、UUG、GGU等18個(gè)密碼子作為最優(yōu)密碼子。該研究結(jié)果為利用葉綠體基因工程技術(shù)改良普通油茶重要經(jīng)濟(jì)性狀奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 普通油茶， 葉綠體， 密碼子偏好， ENC， RSCU

中圖分類號(hào)： Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1000-3142（2018）02-0135-10

Condon preference of chloroplast genome in Camellia oleifera

WANG Pengliang1，3*， YANG Liping2， WU Hongying2， NONG Youliang1， WU Shuangcheng1， XIAO Yufei3， QIN Zihai3， WANG Huayu1，2， LIU Hailong3

（ 1. Guangxi Key Laboratory of Beibu Gulf Marine Biodiversity Conservation， Qinzhou University， Qinzhou 535011， Guangxi， China； 2. Qinzhou Key Laboratory of Plant Biotechnology， Qinzhou Forestry Science Insititute， Qinzhou 535099， Guangxi， China； 3. Guangxi Key Laboratory of Special Non-Wood Forest Cultivation and Utilization， Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Science Institute， Nanning 530002， China ）

Abstract： With the rapid development of the industry and increase of planting area of Camellia oleifera， the harvest was still affected by the factors such as the tolerance of disease， insect and drought as well as mating compatibility. Genetic engineering of chloroplast was an effective way to improve the important traits of plant. In order to improve the important traits of C. oleifera， it was necessary to carry out the analysis on codon preference of its chloroplast genome. The whole genome sequence of chloroplast in C. oleifera taken as raw material， 51 CDS who were longer than 300 bps， started with ATG and not repeated were screened for future analysis. The codon preference was conducted by the CodonW software. The results indicated that the GC content of the third base of genetic code was 27.55% and effective number of codons ranged from 35.23 to 56.67 with an average of 46.09 and then 29 codons of 30 whose RSCU were more than 1 ended with A or U. Neutral plot analysis showed the correlation between GC12 and GC3 was not significant and the coefficient of correlation and regression was 0.143 and 0.057 3， respectively. Frequency analysis showed 55% and 25% of the ENC ratio of genes focused on the region of 0-0.1 and 0.1-0.2. Correspondence analysis indicated the first axis accounted for 10.12 variation and the rested three axises accounted for 9.36%， 7.97% and 7.46% and the first four axises accounted for 34.91% in total. All the methods used in this study showed that codon preference was affected by not only mutation and but also selection. Finally the 18 optimal codons including CUU， AUU， GUU， GUA， UAA， CAA， AAA， GAC， GAA， CCU， ACU， GCU， GCA， UGU， CGU， AGU， UUG， GGU were determined. This work provides plenty of information for improving important traits of C. oleifera utilizing the genetic engineering of chloroplast.

Key words： Camellia oleifera， chloroplast， codon preference， effective number of codon， relative synonymous codon usage

普通油茶（Camellia oleifera）是山茶科（Theacae）山茶屬（Camellia）一類植物，是我國南方最重要的木本食用植油料物種之一（張恩慧等， 2016）。目前，油茶最具價(jià)值的部分為油茶果。茶籽油富含多種對(duì)人體健康有益的成分，對(duì)于提高人體的健康水平有很大影響，尤其是在人體免疫力和預(yù)防高血壓等方面，因此是一種非常優(yōu)質(zhì)的食用油，被譽(yù)為“東方的橄欖油”；同時(shí)茶籽油還含有多種有益于皮膚的成分，易于吸收，無刺激性，所以常被用于調(diào)制藥膏和高級(jí)化妝品的用油（莊瑞林， 2007）；其果殼由木質(zhì)素、半纖維素和纖維素組成，可以用來制作糠醛、木糖醇、培養(yǎng)基、活性炭等；茶籽粕可以直接用于制作肥料及提取茶皂素、鞣質(zhì)（單寧）、黃酮、生物堿等生物活性物質(zhì)。

當(dāng)前由于我國人口規(guī)模增長和居民收入水平提高，我國食用植物油消費(fèi)總量快速增長，盡管近年來植物油生產(chǎn)穩(wěn)步增長，然而消費(fèi)增速高于生產(chǎn)增速，缺口仍然較大（張?chǎng)悾?2016）。國家主動(dòng)調(diào)整油料物種產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，由于油茶油質(zhì)好、生長快、壽命長、適應(yīng)性強(qiáng)、不占用耕地等優(yōu)點(diǎn)，油茶產(chǎn)業(yè)得到重視，油茶產(chǎn)業(yè)獲得快速發(fā)展，新品種數(shù)量增加，推廣面積持續(xù)擴(kuò)大。到目前為止，全國油茶種植面積約為426.67萬hm2（羅晨，2016）。

油茶產(chǎn)量持續(xù)增長，但油茶生產(chǎn)中還會(huì)遇到以下問題：首先，近年來大面積油茶病害的發(fā)生，如炭疽病，軟腐病和葉腫病（徐麗萍和檀根甲， 2015）；其次，大規(guī)模蟲害的出現(xiàn)，如蚧殼蟲，象鼻蟲等；第三，由于油茶的抗旱性弱導(dǎo)致低齡油茶植株死亡率高，引起油茶落花、落果，降低產(chǎn)量（左繼林等， 2012； 陳永忠等， 2014）；最后，油茶的交配親和性也嚴(yán)重影響了油茶的產(chǎn)量（常維霞和姚小華， 2016； 常維霞等， 2016）。

基因工程技術(shù)是改良植物重要性狀的有效手段 （王關(guān)林和方宏筠， 2014）。葉綠體基因組是理想的轉(zhuǎn)化載體，高表達(dá)優(yōu)勢(shì)明顯，同時(shí)能將轉(zhuǎn)化基因的擴(kuò)散控制在最低程度（Daniell & Chase， 2004）。葉綠體基因組中存在密碼子偏好，而且不同物種間密碼子偏好差異顯著（Morton， 1999； Liu & Xue， 2005）。為了更好地設(shè)計(jì)葉綠體高效表達(dá)載體，進(jìn)一步利用葉綠體基因工程技術(shù)改良油茶重要性狀，有效降低油茶產(chǎn)量損失，分析普通油茶葉綠體基因組密碼子偏好十分必要。

1 材料與方法

1.1 序列材料

根據(jù)已報(bào)道的葉綠體基因組的GenBank登錄號(hào)NC_023084.1（Shi et al， 2013），登陸NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），搜索并下載完整普通油茶葉綠體基因組序列及其CDS（Coding DNA Sequence），序列總長度為156 971 bp，共包含87條編碼蛋白的CDS。由于短序列無法正確計(jì)算有效密碼子數(shù) （Wright， 1990），為了減少樣本誤差，本研究選擇以ATG為起始密碼子的非重復(fù)且長度大于300 bp的序列進(jìn)行分析。

1.2 方法

1.2.1 密碼子偏好參數(shù)計(jì)算 以選取的CDS為研究對(duì)象，使用CodonW 1.4.2軟件和在線程序CUSP（http：//imed.med.ucm.es/EMBOSS/）分析密碼子使用偏好參數(shù)，即有效密碼子數(shù)（Effective Number of Codon， ENC）、相對(duì)同義密碼子使用度（Relative Synonymous Codon Usage， RSCU）、GC、GC1、GC2、GC3、GC3s。其中，GC、GC1、GC2、GC3分別代表了基因CDS序列的GC總含量和密碼子的對(duì)應(yīng)位置上的GC含量，GC3s為同義密碼子第三位的GC含量。

1.2.2 中性繪圖分析 中性繪圖是一種可初步判斷影響密碼子使用偏好因素的方法。首先計(jì)算密碼子GC1和GC2的平均值GC12，再以計(jì)算出的平均值為縱坐標(biāo)，以GC3為橫坐標(biāo)作散點(diǎn)圖，圖中每一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)基因的位置。由中性繪圖可分析密碼子的前兩位堿基和第三位堿基的關(guān)系，從而判斷密碼子使用偏好由突變或選擇造成。

1.2.3 ENC-plot繪圖 以GC3為橫坐標(biāo)，ENC為縱坐標(biāo)，構(gòu)建二維散點(diǎn)圖，并在圖中構(gòu)建出ENC值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)基因點(diǎn)分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線附近，這代表密碼子偏好性只是受到了突變作用的影響，如果各基因點(diǎn)集中在預(yù)期曲線下方，表明密碼子偏好更多受選擇影響。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式如下（Wright， 1990）：

ENC=2+GC3+29GC23+（1-GC3）2

1.2.4 對(duì)應(yīng)性分析 對(duì)應(yīng)性分析是一種利用多元統(tǒng)計(jì)探究不同基因密碼子變異趨勢(shì)的方法。利用CodonW軟件的RSCU對(duì)應(yīng)分析功能，將所有基因分布到59維向量空間，從而反映出密碼子使用偏好特點(diǎn)。通過分析基因位置探究基因向量及基因間的值的變異程度，推測(cè)導(dǎo)致密碼子偏好發(fā)生的原因。

1.2.5 最優(yōu)密碼子確定 以ENC偏好性為標(biāo)準(zhǔn)排序，兩端各選出10%基因，分別建立高低偏性庫，取兩庫中ΔRSCU>0.08的密碼子作為高表達(dá)優(yōu)越密碼子（楊惠娟等， 2012； 楊國鋒等， 2015）。將高表達(dá)優(yōu)越密碼子與高頻密碼子相比較，確定出最優(yōu)密碼子（劉慶坡和薛慶中， 2004； 續(xù)晨等， 2010； 羅洪等， 2015； 胡莎莎等， 2016）。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子組成分析

根據(jù)密碼子使用偏好分析要求，本文篩選到51條CDS，再利用CodonW軟件和CUSP程序?qū)Y選出的CDS進(jìn)行分析。表1結(jié)果表明，密碼子第一位的GC平均含量為46.86%、第二位為39.28%、第三位為27.55%，第三位的GC含量明顯小于前兩位的GC含量，而且相差較大，說明普通油茶葉綠體基因密碼子偏好于A和U結(jié)尾。 ENC范圍在35.23～56.67之間，平均值為46.09。ENC值小于35說明密碼子偏性強(qiáng)，高于35則說明偏性比較弱的標(biāo)準(zhǔn)（Jiang et al， 2008），說明普通油茶葉綠體基因密碼子偏性較弱。

相關(guān)分析結(jié)果（表2）顯示，GC和GC1、GC2、GC3的相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平，其相關(guān)系數(shù)分別為0.829、0.766、0.379。GC1和GC2的相關(guān)性也達(dá)到了極顯著水平，其相關(guān)系數(shù)為0.445，但GC3與GC1，GC2的相關(guān)性均未達(dá)到顯著相關(guān)水平，說明密碼子前兩位的GC含量比較相似，第三位GC含量和前兩位差異較大。ENC與GC3呈顯著相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.350，說明第三位堿基的組成會(huì)對(duì)密碼子的使用偏性有影響。密碼子數(shù)目N與GC3、ENC顯著相關(guān)，表明基因序列長度對(duì)GC3和密碼子的偏好性有一定的影響。

RSCU分析結(jié)果（表3）表明，RSCU值大于1.00的密碼子數(shù)目為30個(gè)。其中，16個(gè)第三位堿基為U；13個(gè)以A結(jié)尾；1個(gè)以G結(jié)尾。這說明普通油茶葉綠體基因組密碼子偏愛以A或U（T）結(jié)尾，不偏好以G或C結(jié)尾的密碼子。

2.2 中性繪圖分析

普通油茶葉綠體基因中性繪圖分析（圖1）顯示， GC12的取值范圍為0.319 6～0.550 4， GC3的范圍為0.191 2～0.371 0。GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)為0.143，相關(guān)性未達(dá)到顯著水平，回歸系數(shù)為0.057 3，說明GC12和GC3 的相關(guān)性微弱。突變對(duì)密碼子第一位、第二位和對(duì)第三位堿基組成的影響不同。各基因都落在對(duì)角線的上方，并且沒有對(duì)角線上或沿著對(duì)角線分布。突變不是密碼子偏性形成的主要原因。因此，普通油茶葉綠體基因密碼子的使用更多地受選擇的影響。

2.3 ENC-plot繪圖

以GC3為X軸，ENC為Y軸作圖（圖2），圖2中各點(diǎn)為基因分布情況。代表基因的各點(diǎn)基本都落在了標(biāo)準(zhǔn)曲線的下方。為了能更直接地顯示出

差異，根據(jù)ENCexp-ENCobsENCexp公式，計(jì)算ENC比值，再統(tǒng)計(jì)ENC比值的分布（表4）。頻數(shù)分布顯示，55%的基因的ENC比值集中分布在0～0.1，25%的基因ENC比值分布在0.1～0.2的區(qū)間，結(jié)果表明ENCexp與ENCobs有差異。假如ENCexp與ENCobs接近時(shí)，表明基因的密碼子受突變影響；本文中ENCexp與ENCobs有差異較大，所以普通油茶葉綠體基因組密碼子偏好更多受選擇的影響（胡莎莎等， 2016）。

2.4 對(duì)應(yīng)性分析

RSCU的對(duì)應(yīng)分析結(jié)果表明，第一向量軸占10.12%的差異，第二向量軸占9.36%的差異，其余兩軸分別為7.97%和7.46%，前4軸累計(jì)差異為34.91%，說明第一軸對(duì)普通油茶葉綠體基因組密碼子偏好性造成的影響最大。第一軸與GC3的相關(guān)性為0.215和ENC的相關(guān)性為0.104，均相關(guān)不顯著。這說明GC3是對(duì)普通油茶葉綠體基因組密碼子偏好性造成影響的不大，密碼子的偏好性受到其他多方面因素的影響。以Axis 1為橫坐標(biāo)，Axis 2為縱坐標(biāo)，從各基因在第一、第二軸的分布（圖3）看出，與遺傳結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因分布相對(duì)比較集中，說明兩個(gè)類基因的密碼子使用是比較接近的；而其他類別基因可能是因?yàn)槊艽a子使用模式不同，分布比較分散。

2.5 最優(yōu)密碼子分析

以密碼子的有效數(shù)量ENC為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有基因的CDS序列進(jìn)行排序，先從排序結(jié)果的兩端各選取5個(gè)基因分別建立高表達(dá)基因庫和低表達(dá)基因庫；然后使用CodonW計(jì)算兩個(gè)表達(dá)庫中的RSCU值，并計(jì)算高低庫ΔRSCU值（表5）；最后確定22個(gè)密碼子（表中帶星號(hào)的）為普通油茶葉綠體基因組高表達(dá)優(yōu)越密碼子，10個(gè)以U結(jié)尾、6個(gè)以A結(jié)尾、5個(gè)以C結(jié)尾和1個(gè)以G結(jié)尾。

先將22個(gè)高表達(dá)優(yōu)越密碼子和表3得出的30個(gè)高頻密碼子相比較，然后選取共有的密碼子作為最優(yōu)密碼子，最后確定了18個(gè)密碼子為普通油茶葉綠體基因組最優(yōu)密碼子，分別為CUU、AUU、GUU、GUA、UAA、CAA、AAA、GAC、GAA、CCU、ACU、GCU、GCA、UGU、CGU、AGU、UUG、GGU，其中有2個(gè)密碼子以G或C結(jié)尾，其余的16個(gè)密碼子均以A或U結(jié)尾。

3 討論

在20種氨基酸中，除了甲硫氨酸和色氨酸只有單個(gè)密碼子外，其他18種氨基酸均有多種密碼子，即遺傳密碼子存在簡并性。密碼子簡并性常常表現(xiàn)在第三位密碼子上（朱圣庚和徐長發(fā)， 2016），因此在普通油茶葉綠體基因組堿基組成中發(fā)現(xiàn)，GC1、GC2顯著相關(guān)，GC3與GC1、GC2相關(guān)不顯著，且GC3小于GC1和GC2，說明普通油茶葉綠體基因組的堿基組成偏向于A和T，第3位密碼子通常以A、T結(jié)尾。這與多數(shù)植物，如文心蘭（李冬梅等， 2012）、甜蕎（羅洪等， 2015）、苦蕎（胡莎莎等， 2016）、蝴蝶蘭（續(xù)晨等， 2010）、蒺藜苜蓿（楊國鋒等， 2015）等物種的特點(diǎn)相一致。

突變和選擇是密碼子偏好形成的主要原因。ENC-plot分析結(jié)果表明，部分基因落點(diǎn)位于標(biāo)準(zhǔn)曲線附近，基因的實(shí)際ENC值與理論ENC值基本一致，說明這些密碼子偏好受到GC含量（突變）的影響較大；而大多數(shù)基因的落點(diǎn)離標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)，實(shí)際ENC值與理論ENC值的差異較大，受選擇的影響較大。因此，普通油茶葉綠體密碼子偏好受到突變的影響，更多的是受到了選擇的作用。

中性繪圖和對(duì)應(yīng)性分析均支持普通油茶密碼偏好受突變和選擇共同作用。這與已報(bào)道的文心蘭（李冬梅等， 2012）、蝴蝶蘭（續(xù)晨等， 2010）、銀白楊（Zhou et al， 2008）、甜蕎（羅洪等， 2015）等有相似的結(jié)論；本文結(jié)果也印證了選擇對(duì)葉綠體密碼子使用起顯著影響（Morton， 1998）。

本研究采用由高表達(dá)優(yōu)越密碼子和高頻密碼子中選出兩者共有的密碼子，可以避免由于單方法存在問題而導(dǎo)致結(jié)果出錯(cuò)，最終確定了CUU、AUU、GUU、GUA、UAA、CAA、AAA、GAC、GAA、CCU、ACU、GCU、GCA、UGU、CGU、AGU、UUG、GGU等18個(gè)密碼子為普通油茶葉綠體基因的最優(yōu)密碼子。在此基礎(chǔ)上可以通過對(duì)目的基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，提高該基因的表達(dá)效率，從而為改良普通油茶重要性狀奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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