霍慶迪 趙慶芳 馬艷 李巧峽

摘 要： 該研究以甘肅省中部渭源縣大豆—當歸輪作地、連作3年的當歸地和荒地植物根際土為材料，采用 PCR-RFLP法研究不同耕作方式下根際土壤細菌的群落多樣性。應(yīng)用CTAB-SDS法提取土壤微生物總DNA，建立土壤菌群16S rRNA基因克隆文庫。用Hae Ⅲ， Hha Ⅰ和Hinf Ⅰ對陽性克隆子進行酶切指紋圖譜分析，測序并繪制系統(tǒng)進化樹。經(jīng)過初步分析，荒地、輪作地和連作地三者之間根際土壤細菌群落在種群數(shù)量和多樣性上無顯著差異，但在組成結(jié)構(gòu)上存在明顯差異，尤其是輪作和連作地。結(jié)果表明：輪作地和荒地的優(yōu)勢種群均為變形菌門，連作地的優(yōu)勢種群是擬桿菌門。進一步分析發(fā)現(xiàn)，對農(nóng)作物有利的鞘脂單胞菌屬（屬于變形菌門）僅在輪作和荒地中出現(xiàn)，而在其他作物連作障礙中出現(xiàn)的無色桿菌屬（屬于擬桿菌門）僅在當歸連作地中出現(xiàn)。因此，不同耕作方式對土壤細菌的群落組成結(jié)構(gòu)影響較明顯，土壤細菌群落組成結(jié)構(gòu)的變化可能是當?shù)禺敋w連作障礙的重要原因之一；而輪作可有效提高根際土壤中細菌群落組成的多樣性，并使有益細菌種群增加，改善土壤微生態(tài)環(huán)境，有效防止當歸根腐病的發(fā)生。

關(guān)鍵詞： 當歸， 連作障礙， 根際微生物， 16S rDNA， PCR-RFLP

中圖分類號： Q948

文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2018）02-0241-09

Effects of different cultivation methods on bacterial community diversity in rhizosphere soil of Angelica sinensis

HUO Qingdi， ZHAO Qingfang*， MA Yan， LI Qiaoxia

（ College of Life Sciences， Northwest Normal University， Lanzhou 730070， China ）

Abstract： Angelica sinensis is a genuine regional drug in the Gansu Province of China， continuous cropping obstacles seriously affect the yield and quality of angelica in recent years. In this paper， the rhizosphere soil was sampled from the fields of Angelica-soybean rotated， angelica continuous cultivations and wasteland in Weiyuan County of Gansu Province. We aimed to know the differences of community structure and diversity of bacteria population in the three sampling sites， and provide some useful advises for the reasonable planting of angelica. The method of 16s rRNA PCR-RFLP （polymerase chain reaction-restriction fragment length polymor-phism） was used for the comparative analysis of rhizosphere bacterial community structure and diversity. The total DNA was extracted from the soil microbes by CTAB-SDS method and 16S rRNA gene cloning library was established. The fingerprints were analyzed by restriction fragment length polymorphism （RFLP） by using the Hae Ⅲ， Hha Ⅰ and Hinf Ⅰ restriction enzymes， respectively. Then phylogenetic tree was set up according to the 16S rRNA sequences. After preliminary analysis， there was no significant difference in bacteria population quantity and diversity indices of rhizosphere soils among wasteland， rotated planted fields and continuous cultivation fields， but there was very obvious difference in community structure of bacteria among the three fields， especially in rotated planted fields and continuous cultivation fields. The results showed that the dominant population of bacteria was Proteobacteria in rotation fields and wasteland， while the dominant population of bacteria was Bacteroidetes in continuous cultivation fields of angelica. The strains of Sphingomonas that belonged to Proteobacteria， which were beneficial to the growth of crop， appeared only in the rotation fields and wasteland， and the Achromobacter that belonged to Bacteroidetes associated with the continuous cropping obstacle appeared only in the continuous cropping fields. Our results suggested that the different ways of angelica cultivation play an important role in bacteria community structure. Meanwhile， the continuous cropping obstacle might be associated with the changes of bacterial community structure in rhizosphere soils of cropped angelica. In conclusion， we think that the rotation can effectively enhance the composition of the bacterial community structure， increase the beneficial bacterial population， improve the soil microenvironment， and prevent the root rot of angelica.

Key words： Angelica sinensis， continuous cropping obstacle， rhizosphere microbe， 16S rDNA， PCR-RFLP

當歸（Angelica sinensis）是重要的大宗交易中藥材，以甘肅所產(chǎn)品質(zhì)最佳，常用于貧血、高血壓、慢性支氣管炎、哮喘和心血管疾病的治療。隨著人們生活水平的提高及其適用范圍擴大，需求量逐年增加，但高品質(zhì)中藥材產(chǎn)地的地域性嚴重限制了當歸種植業(yè)快速增長。在實際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用連作來解決類似的矛盾，而當歸長期連作卻容易導(dǎo)致連作障礙，常常表現(xiàn)為當歸的生長勢變?nèi)?，單位面積年產(chǎn)量逐年降低，中藥品質(zhì)下降，易感染病蟲害，市場競爭能力不斷下降（馬瑞君等，2008）。

土壤細菌群落組成和結(jié)構(gòu)可作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康情況、生產(chǎn)力大小及環(huán)境干擾程度的新指標（Mendes et al， 2011；Hermans et al， 2017）。長期研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物各菌種的比例關(guān)系失衡及種群數(shù)量變化較大是傳統(tǒng)耕地連作障礙的主要原因之一（Ling et al， 2009；劉星等，2015），單一物種長時間的連作后微生物區(qū)系由適宜作物穩(wěn)定生長的“細菌型”土壤逐步向?qū)χ参锷L不利或者直接抑制其快速生長“真菌型”土壤轉(zhuǎn)變，抵抗和應(yīng)對生物和非生物脅迫的能力降低，使作物更容易染?。n劍等，2011）。分子生物學手段與傳統(tǒng)微生物群落生態(tài)研究相互滲透和交叉，為研究連作障礙耕地微生物群落組成和變化提供了強有力的技術(shù)支持。本文以當歸連作地、大豆—當歸輪作地和荒地為樣地，將PCR-RFLP技術(shù)和細菌的16S rDNA基因測序手段相結(jié)合，比較了不同耕作方式下細菌群落結(jié)構(gòu)的變化差異，闡明了耕作方式對細菌數(shù)量和組成結(jié)構(gòu)的影響，以探討根際細菌多樣性和連作障礙之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

土壤采樣地會川鎮(zhèn)位于甘肅省中部渭源縣境內(nèi)。用五點采樣法收集大豆—當歸輪作地、3年連作的當歸連作地（該區(qū)域地根腐病嚴重）和荒地的土壤，按李國慶（2009）的方法收集根際土后用消毒毛刷收集根表土，兩者混合即為本研究所用根際土壤，消毒紙袋收集密封后保存于-20 ℃冰箱內(nèi)。

1.2 樣地微生物總DNA的提取及目的片段擴增

參照陳旭玉等（2008）的CTAB-SDS法提取土壤微生物總DNA，選用細菌通用引物799F /1492R對提取的總DNA特異性擴增（蘭阿峰等，2014），并獲得目的片段。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2 μL模板DNA，10 μL 2×Taq Master Mix，上下游引物各1 μL（濃度為10 μmol·L-1），6 μL ddH2O。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖電泳檢測，用StarPrep快速DNA膠回收試劑盒（康潤生物）進行純化。

1.3 PCR-RFLP分析

目的片段與PTG19-T vector連接后轉(zhuǎn)入Trans5α中，經(jīng)藍白斑實驗篩選后，使用通用引物M13-47/M13-48對陽性克隆進行檢驗。菌液PCR產(chǎn)物分別用內(nèi)切酶Hae Ⅲ/Hha Ⅰ/Hinf Ⅰ消化（1 μL消化酶，3 μL 10×Quick Cut Buffer，10 μL PCR產(chǎn)物，16 μL ddH2O，37 ℃水浴30 min）。酶切產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，染色凝膠成像后分析帶型。統(tǒng)計酶切圖譜上經(jīng)內(nèi)切酶處理后片段的大小并進行“0-1”分析結(jié)合Ntsys2.02對結(jié)果進行統(tǒng)計。定義經(jīng)兩種酶切條帶形都相同的克隆子為一個OTU（Operational Taxonomic Unit，操作分類單位），通過統(tǒng)計單個樣地OUT總數(shù)及單個OTU所包含的克隆子數(shù)，計算土壤中細菌的多樣性。

（1）克隆文庫覆蓋率（Coverage）：

C=1-nN

式中，n為克隆文庫中僅一個序列的OTU數(shù)，N為單文庫中的OTU數(shù)。

（2）辛普森多樣性指數(shù)（D-Simpson index）：

D=1-i=ni=1[ni（ni-1）]/N（N-1）

式中，N為單個文庫中序列數(shù)，ni為第i種OUT中包含的序列數(shù)，n為單文庫中序列數(shù)。

（3）香農(nóng)指數(shù)（H-Shannon index）：

H=si=1pilnpi

式中，pi為第i種OUT中序列數(shù)在單文庫序列總數(shù)中的比例，n為單文庫中OUT個數(shù)。

（4）均勻度指數(shù)（Evenness index）：

E=HlnS

式中，H為香農(nóng)指數(shù)，S為單文庫中總序列數(shù)。

（5）豐富度指數(shù)（Schaol index）：

Schaol=Sobs+F1（F1-1）2（F2+1）

式中，Sobs為單文庫中OUT個數(shù)，F(xiàn)1和F2分別為克隆文庫中只包含1個和2個序列的OUT個數(shù)。

1.4 克隆文庫系統(tǒng)發(fā)育分析

在各樣地中分別取30個具有代表性的OTU測序，測序結(jié)果使用VecScreen和Bellerophon（Venter & Smith，2004）去除載體序列和嵌合體，通過BLAST進行序列比對。選取相似度不小于95%的序列，在MEGA6.0中使用N-J法聚類（Bootstrap-1000）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。所得序列的登錄號為KR133580-KR133626。

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA的提取及16S rDNA基因選擇性擴增

通用引物擴增的目的片段大小約為730 bp，如圖1所示，目的條帶單一，擴增效果良好，可以用于后續(xù)的實驗。

2.2 細菌16S rDNA的酶切結(jié)果

土壤微生物群落的豐富度、多樣性、均勻度與優(yōu)勢度大體呈負相關(guān)，能較好地表征了群落的綜合特征?；牡禺a(chǎn)生97種OTU類型，大豆—當歸輪作地91種，連作地最少為88種。單一克隆所占比例為荒地8.21%，當歸連作地4.55%，輪作地最少只有3.15%。

從表1可以看出，三個采樣地的庫容值都不小于70%，說明該文庫能較全面反映三樣地細菌群落的α多樣性（游偲等，2014）。均勻度指數(shù)、辛普森指數(shù)、香農(nóng)多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均為荒地最大連作地最小，說明荒地中細菌物種豐富分布均勻但物種優(yōu)勢度最不明顯，連作地則相反。

2.3 細菌16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

使用在線工具VecScreen、Bellerophon處理測序結(jié)果，使用BLAST進行序列比對，通過MEGA 6.0中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2至圖4所示。

三樣地共有8個類群，其中輪作與連作對酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和浮霉菌門（Planctomycetes）的組成和數(shù)量有比較大的影響。其中變形菌門（Proteobacteria）是輪作地和荒地的優(yōu)勢菌群（38.5%和38.9%）。本研究中α-變形菌綱只包含A18、C3、C13和C14，其余均為β-變形菌綱。A1和A11屬于β-變形菌綱草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）。B13和B21屬于β-變形菌綱無色桿菌屬（Achromobacter）。擬桿菌門為當歸連作地的優(yōu)勢菌群（20.0%），擬桿菌門在輪作地中未出現(xiàn)，A21和27屬于浮霉菌門，未培養(yǎng)細菌占總OUT數(shù)的39.1%。值得指出的是連作地B4、B22、B25在BLAST分析中分別屬于Denitratisoma屬（93%，變形菌門）、Gemmatimonas屬（90%，芽單胞菌門）和Terrimonas屬（99%，擬桿菌門），B4和B22未達到95%皆為未培養(yǎng)細菌，但B25為何不能歸屬為擬桿菌門尚無法解釋。

3 討論

隨著不同領(lǐng)域?qū)B作障礙研究的深入，特別是多元組學和系統(tǒng)生物學算法的應(yīng)用，為人們從整體上了解和研究農(nóng)作物連作障礙發(fā)生的機制提供了更好的幫助。連作障礙的發(fā)生并不是單個或是少數(shù)幾個因素的簡單組合導(dǎo)致的，而是涉及到農(nóng)作物-土壤微生態(tài)環(huán)境-農(nóng)作物之間非常復(fù)雜的相互作用，此觀點得到了大多數(shù)學者的認同。

不同作物發(fā)生連作障礙的原因不一，但是土壤微生態(tài)環(huán)境的變化是導(dǎo)致連作障礙的主要原因之一，其中以農(nóng)作物根際的變化尤為顯著。很多研究學者將改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成作為調(diào)節(jié)根際微生態(tài)環(huán)境的重要手段，并以此來改善長期連作對農(nóng)作物的影響。黃瓜連作研究顯示，拮抗菌木霉菌（Trichoderma spp.）種群數(shù)量逐年下降，具有致病潛力的尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporium）則漸漸成為優(yōu)勢菌群（胡元森等，2006）。針對棉花（李銳等，2015）不同連作年限的研究表明隨著年限的不斷延長，細菌菌落組成越發(fā)單一，多樣性也逐年降低。與黃瓜連作不同，鐮刀菌和枯草芽孢桿菌隨棉花連作年限的增加呈先下降后升高，這可能與棉花連作年限較長有關(guān)。本實驗將分子實驗技術(shù)應(yīng)用到當歸的連作障礙研究中，與Trabelsi et al（2012）和Larkin et al（2010）用不同農(nóng)作物分別與連作馬鈴薯進行輪作的實驗結(jié)果不同，土壤細菌種群數(shù)量和多樣性在大豆當歸輪作地和當歸連作地之間差異不顯著。主要原因可能有以下兩個方面：一方面是生物因素，細菌本身的特性和不同植物根分泌物的差異對根際細菌的影響；另一方面是非生物因素，如泥土類型、泥土溫度、有機質(zhì)含量、泥土濕度、酸堿度等。除上述原因之外，不同菌種之間競爭能力差異和對生存適應(yīng)性能力大?。≒hilippot et al，2013；Jordan et al，2013）都會對根際微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

耕作方式的改變對分布于該區(qū)域土壤內(nèi)的細菌種群數(shù)量和多樣性影響不顯著，但對細菌群落組成結(jié)構(gòu)具有明顯的影響。文庫中不少序列來自未純培養(yǎng)細菌，表明該研究區(qū)域可能存在很多新細菌。擬桿菌門是連作地的優(yōu)勢種群，輪作地和荒地的均為變形菌門，本研究結(jié)果同付琳等（2012）對不同施肥條件下香蕉根際土可培養(yǎng)細菌區(qū)系變化相似。α-變形菌綱均為具固氮能力的鞘氨醇單胞菌屬，對西瓜（王志剛等，2015）連作障礙研究中發(fā)現(xiàn)該屬的細菌具有較高的解磷能力，可分泌IAA對改善根系組成具有一定作用。無色桿菌屬在三七根腐病病根和黃瓜枯萎病植株中出現(xiàn)（張智慧等，2014；高玉亮等，2015），間接說明了當歸根腐病的發(fā)生和無色桿菌屬也具有一定聯(lián)系。芽單胞菌門和浮霉菌門只在輪作地中存在，說明與荒地相比大豆—當歸輪作可以使這一類群數(shù)量增加而連作會使這一類群數(shù)量減少，該現(xiàn)象顯示輪作地的微生物環(huán)境有利于此種細菌的生長。

對不同耕作方式下當歸耕地土細菌的多樣性研究表明，土壤微生態(tài)環(huán)境的變化同當歸連作障礙發(fā)生或危害加重之間存在直接或者間接的聯(lián)系，長期連作導(dǎo)致土壤細菌的多樣性、組成結(jié)構(gòu)和數(shù)量均發(fā)生變化。同時，微生態(tài)環(huán)境的變化也加重了連作障礙對植物的危害。因此，根據(jù)目前的研究結(jié)果，在耕地面積較少的情況下，我們建議在當歸種植過程中采取以下措施：（1）盡量采用輪作的耕作方式，輪作的作物盡量采用具有地上生產(chǎn)力與經(jīng)濟價值的植物（如大豆、小麥、玉米等），避免與根莖生產(chǎn)力的作物輪作（如馬鈴薯、蘿卜等）；（2）投放生物菌劑，通過人為的投放有益細菌，提升土壤微生物的多樣性，維持土壤微生態(tài)環(huán)境的動態(tài)平衡，增強當歸的抵抗力；（3）改變土壤的理化性質(zhì)，例如深耕30 cm以上可以明顯改善土壤的水、氣、熱狀況，促進作物根系深扎，增強當歸對不利因素的抵抗力；（4）培育高品質(zhì)的耐連作當歸品種，這是對抗連作障礙最經(jīng)濟的辦法；（5）生物消毒法，通過人為添加易降解有機物改變增強土壤還原性從而抑制病原微生物的生長，目前有關(guān)此類方法的田間研究主要集中在少數(shù)經(jīng)濟作物上（Ebihara & Uematsu， 2014；Butler et al，2014）。

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