楊寶偉

(黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)第四中學(xué)，哈爾濱 150500)

0 前言

自1880年，法國(guó)植物學(xué)家席姆佩爾發(fā)現(xiàn)植物葉綠體以來(lái)，人們對(duì)葉綠體的研究從未止步。自然界中植物通過(guò)葉綠體進(jìn)行光合作用，而光合作用就是將二氧化碳和水轉(zhuǎn)化為糖類(lèi)，儲(chǔ)存能量釋放氧氣。因此，光合作用幾乎是植物生長(zhǎng)不可或缺自然界不可或缺的過(guò)程。分子生物學(xué)的進(jìn)步大大促進(jìn)了植物葉綠體的研究水平。1960年人們發(fā)現(xiàn)葉綠體DNA(chloroplast DNA,cpDNA)。 它們是由具有光合作用的藍(lán)細(xì)菌通過(guò)十億年前的內(nèi)分泌事件演化而來(lái)。葉綠體不僅能夠進(jìn)行光合作用，還參與完成了氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的代謝活動(dòng)。其后，科研工作者1986年首次報(bào)道了煙草中葉綠體的全基因組序列。到目前為止已經(jīng)完成了400種以上的植物葉綠體全基因組測(cè)序。開(kāi)展植物葉綠體基因組分子生物學(xué)等方面的研究，前提就是分離出高質(zhì)量的葉綠體。分離植物葉綠體常用的方法有3種：蔗糖密度梯度離心法、Percoll密度梯度離心法和高鹽-低pH 法。本研究高鹽-低pH 法探究甜菜葉綠體的分離提取方法，為深入了解甘薯葉綠體基因組、分析挖掘相關(guān)基因等研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料處理

以工大甜單1號(hào)為材料，材料種植于哈工大甜菜功能基因組實(shí)驗(yàn)室育苗中心，再4對(duì)真葉期，室溫下暗處理3-4 d，充分消耗葉片中的淀粉多糖等，減少其對(duì)葉綠體分離的影響。

1.2 高鹽-低pH法葉綠素提取

取甜菜葉片20-30 g加入緩沖液 A：1.25 mol/L NaCI，20 mmol/L EDTA-Na2，50 mmol/L Tris-HCI(Ph 8.0)，0.25 mol/L Vc，1 mmol/L DTT,0.1% BSA。勻漿處理，低速勻漿3～5次，高速勻漿3～5次，每次6～10 s。勻漿結(jié)束后，先用8層紗布過(guò)濾勻漿液，將濾液收集完整，分裝到50 mL離心管中，4℃條件下1 000 r/min離心4 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的50 mL離心管中，棄沉淀，該步驟重復(fù)1次;將上清液液轉(zhuǎn)移到新的50 mL離心管中，4 000 r/min離心15 min，收集沉淀?xiàng)壣锨逡?；?5 ml預(yù)冷的緩沖液B:20 mmol/L EDTA-Na2，50 mmol/L Tris-HCI(pH 8.0)，0.1% BSA，1.25 mol/L NaCI，1 mmol/L DTT)輕輕重懸沉淀，4 000 r/min離心15 min，收集沉淀，棄上清液，重復(fù)1次該步驟；用25 mL緩沖液 C:7 mmol/L EDTA-Na2，40 mmol/L蔗糖，50 mmol/L Tris-HCI(pH 8.0)，0.1% BSA)再重懸沉淀。4 000 r/min離心15 min，收集沉淀，棄上清液；再用2 ml 緩沖液C重懸沉淀，同時(shí)加入 DNaseI(8～10 μL)和10 μL 的2 mmol/L MgCI2，37℃水浴鍋孵育30 min，期間搖晃混勻8～10 次，加 入1.7 mL 的 EDTA-Na2(500 mmol/L)，終止該酶解反應(yīng)，室溫靜置8～10 min；加入 40 mL 緩沖液D ：1.25 mmol/L NaCI，50 mmol/L EDTA-Na2，50 mmol/L Tris-HCI(pH 8.0)。50 mmol/L NaF?；靹蛞院? 000 r/min離心20 min，收集沉淀?xiàng)壣锨逡?，? mL緩沖液E:100 mmol/L NaCI，50 mmol/L EDTA-Na2，100 mmol/L Tris-HCI(pH 8.0)，1 mmol/L DTT重懸沉淀，得到完整的葉綠體溶液。

1.3 葉綠體 DNA的提取

葉綠體溶液中加入 0.5 ml 20%SDS 溶液破碎葉綠體，加入10 μL蛋白酶K(10 mg/ml)去除蛋白質(zhì)，55℃水浴3 h；加入0.5 mL 5 mol/L KAc冰浴20 min．加入等體積的飽和酚抽，10 000 r/min離心10 min；收集上清液加入0.5 mL CTAB/NaCI溶液和0.5 mL體積比為24∶1的氯仿/異戊醇并充分混勻，以10 000 r/min離心10 min；在上清液中加入0.05 mL的3 mol/L NaAc和1 mL的無(wú)水乙醇，置于-20℃環(huán)境中過(guò)夜。以10 000 r/min離心 20 min后，棄置上清液，收集沉淀物，用70%酒精漂洗2次，自然涼干．沉淀加入100～500 μL 無(wú)菌水，得到cpDNA 溶液。

1.4 葉綠體DNA檢測(cè)

使用NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)測(cè)定葉綠體 DNA 溶液的濃度與純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體分離結(jié)果比較

通過(guò)分析表明，高鹽-低pH 法操作簡(jiǎn)單，利用普通離心機(jī)多次離心即可滿(mǎn)足分離要求，且葉綠體產(chǎn)率較高，葉片中葉綠體約為 7.344×107個(gè)/g。在目鏡10倍和物鏡40倍的顯微鏡下可觀察到清晰完整的葉綠體。

2.2 葉綠體DNA檢測(cè)

用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)葉綠體 DNA 純度與濃度，高鹽-低pH 法的 A260/A280比值為1.86，介于1.80和2.00之間,質(zhì)量濃度分別為 80.1 ng/μL，高鹽-低 pH 法分離 得到的葉綠體DNA 產(chǎn)率較高，鮮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為269 ng/g。

3 討論

本研究結(jié)果表明，使用高鹽-低pH 法均能夠分離得到質(zhì)量較好的甜菜葉片的葉綠體，高鹽-低pH法相較傳統(tǒng)方法具有操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短且產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)。并可用于后續(xù)的葉綠體 DNA、蛋白質(zhì)提取分離工作等。在傳統(tǒng)純化 DNA 過(guò)程中會(huì)在緩沖液中加入抗氧化劑，如β巰基乙醇等，但是其具有刺激性氣味，毒性較大。而本研究所使用 DTT作為抗氧化劑，不僅刺激氣味小，毒性也小低。在裂解葉綠體之前，使用 DNaseI消化核基因組 DNA，能夠有效地降低了核基因組的污染。在分離甜菜葉片葉綠體之前，暗處理3-4 d，可有效地降低葉片中糖分對(duì)葉綠體分離的影響，而且在提取葉綠體DNA 時(shí)，加入 CTAB/NaCI可以去除多糖的污染。