宋魏崔云 張建波 孫淼淼 夏慶欣

摘要目的：探究姜黃素對人胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖抑制作用及對Wnt信號通路的影響。方法：低/中/高劑量觀察組人胰腺癌SW1990細(xì)胞分別以終濃度為20、50、100 μmol/L姜黃素處理，100 μL/孔，對照組細(xì)胞則以等體積生理鹽水處理，分別干預(yù)24、48、72 h。以噻唑藍(lán)（MTT）法及AnnexinV/FITC雙染法分別檢測人胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖及凋亡情況，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）法及細(xì)胞爬片免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測人胰腺癌細(xì)胞SW1990 β鏈蛋白（βCatenin） mRNA及βCatenin蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：干預(yù)72 h后低/中/高劑量觀察組人胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖抑制率（%）分別為（459±132）、（4001±387）、（6098±597）；對照組及低/中/高劑量觀察組人胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡率（%）（814±125）、（1304±103）、（2715±162）、（5921±146）；βCatenin蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）評分（分）分別為（578±056）、（442±061）、（257±058）、（138±063）。觀察組凋亡率顯著高于對照組，βCatenin mRNA相對表達(dá)量及βCatenin蛋白ICC評分顯著低于對照組（P<005），且增殖抑制率、凋亡率隨姜黃素作用濃度增加逐漸升高（P<005），增殖抑制率亦隨干預(yù)時間延長逐漸升高（P<005）；βCatenin mRNA相對表達(dá)量及βCatenin蛋白ICC評分隨姜黃素作用濃度增加逐漸降低（P<005）。結(jié)論：姜黃素可有效下調(diào)人胰腺癌細(xì)胞SW1990 βCatenin基因表達(dá)，抑制Wnt信號通路活化，具有顯著的增殖抑制作用，且具有明顯的時間劑量依賴性。

關(guān)鍵詞胰腺癌細(xì)胞；姜黃素；增殖抑制；Wnt信號通路

Effects of Curcumin on Proliferation Inhibition of Human Pancreatic Cancer Cell

and the Influence on Wnt Signaling Pathway

Song Wei， Cui Yun， Zhang Jianbo， Sun Miaomiao， Xia Qingxin

（Zhengzhou University Affiliated Tumor Hospital， Zhengzhou 450001， China）

AbstractObjective：To explore the proliferation inhibition effect of curcumin on human pancreatic cancer SW1990 cell and the influence on Wnt signaling pathway. Methods：The human pancreatic cancer cells SW1990 in experimentalL/M/H group were treated with final concentration of 20， 50， 100 μmol/L curcumin， 100 μL/hole， and cells in control group were treated with isovolumetric saline. Each group was intervened for 24， 48， 72 h respectively. The proliferation and apoptosis were detected by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） method and AnnexinV/FITC double staining respectively， expression of βCatenin mRNA and βCatenin mRNA protein in human pancreatic cancer SW1990 cell were detected by reverse transcription PCR （RTPCR） method and cell climbing immunocytochemistry technique respectively. Results：72 h after intervened， the proliferation inhibition rates （%） of human pancreatic cancer SW1990 cell in experimentalL/M/H group were 459±132， 4001±387， 6098±597 respectively； Apoptosis rates （%） in control group and experimentalL/M/H group were 814±125， 1304±103， 2715±162， 5921±146 respectively； βCatenin protein immunocytochemistry （ICC） score （score） were 578±056， 442±061， 257±058， 138±063 respectively. The apoptosis rate in experimental groups were higher than that in control， and βCatenin mRNA relative expression and βCatenin protein ICC score were lower than those in control group （P<005）， and the proliferation inhibition rate， apoptosis rate in experimental groups increased gradually with the increase of curcumin action concentration （P<005）. Proliferation inhibition also increased gradually with the lengthen of action time （P<005）； the βCatenin mRNA relative expression and βCatenin protein ICC score decreased gradually with the increase of curcumin action concentration （P<005）. Conclusion：Curcumin can downregulate the expression of βCatenin in human pancreatic cancer SW1990 cell effectively， inhibit the Wnt signaling pathway excitation， and has significant proliferation inhibition effect， which has an obvious timedose dependence.

Key WordsPancreatic cancer cell； Curcumin； Proliferation inhibition； Wnt signaling pathway

中圖分類號：R2855文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.05.044

胰腺癌是臨床比較常見消化系統(tǒng)腫瘤，絕大多數(shù)患者發(fā)病時已經(jīng)處于中晚，患者手術(shù)切除控制率不足20%，5年生存率低下，影響預(yù)后。姜黃素是由姜科植物姜黃中所提取的多酚類色素，其藥理學(xué)作用廣泛，近年來許多研究[12]證實其可有效抑制多種腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，參與多種抗腫瘤途徑，具有直接及間接的抗腫瘤作用，但目前有關(guān)其對人胰腺癌的抗腫瘤作用及機制研究尚少，本研究旨在探究姜黃素對人胰腺癌細(xì)胞SW1990的增殖抑制作用，并初步分析其作用機制。

1材料與方法

11材料

111細(xì)胞株人胰腺癌SW1990細(xì)胞，由中國科學(xué)院上海生物研究所饋贈。

112試劑與儀器姜黃素（純度>98%，美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：B6938）；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒及AnnexinV/FITC雙染凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物公司）；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；兔抗β鏈蛋白（βCatenin）（美國Cell Signaling Technology公司）等。主要儀器AccuriC6型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；JYH27020電泳儀及T100型PCR儀（美國BioRad公司）；XSP11CC倒置生物顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）等。

12方法

121人胰腺癌SW1990細(xì)胞培養(yǎng)、分組與干預(yù)取人胰腺癌SW1990細(xì)胞[3]，加含10%胎牛血清及青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，待細(xì)胞生長至85%左右融合時以025%胰酶消化并常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL，接種于96孔板中，低/中/高劑量觀察組人胰腺癌細(xì)胞SW1990分別以終濃度為20、50、100 μmol/L姜黃素處理，100 μL/孔，對照組細(xì)胞則以等體積生理鹽水處理，各孔均設(shè)置8個復(fù)孔，分別干預(yù)24、48、72 h。

122MTT法檢測人胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖情況細(xì)胞分組及處理同121，各組分別干預(yù)24、48、72 h后，加5 mg/mL MTT溶液，20 μL/孔，37 ℃孵育4 h，加二甲基亞砜，150 μL/孔，檢測各孔490 nm下吸光光度值OD490 nm，計算人胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖抑制率=（1觀察組OD490 nm/對照組OD490 nm）×100%。實驗重復(fù)3次[4]。

123AnnexinV/FITC雙染法[5]檢測人胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡情況細(xì)胞分組及處理同121，干預(yù)72 h后收集各組細(xì)胞，1 000 r/m離心5 min，加195 μL緩沖液懸浮細(xì)胞，加5 μL Annexin VFITC避光孵育15 min，然后加10 μL碘化丙啶（PI）冰浴避光孵育10 min，1 h內(nèi)以流式細(xì)胞儀檢測人胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡率，實驗重復(fù)3次。

124RTPCR法[6]檢測人胰腺癌SW1990細(xì)胞βCatenin mRNA表達(dá)情況細(xì)胞分組及處理同121，干預(yù)72 h后收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增。經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描、分析，以βactin為參照，計算各組人胰腺癌SW1990細(xì)胞βCatenin mRNA相對表達(dá)量。

125細(xì)胞爬片免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)[7]檢測人胰腺癌SW1990細(xì)胞βCatenin蛋白表達(dá)情況取對數(shù)期人胰腺癌SW1990細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105個/mL，接種于6孔板，各孔底部均鋪有無菌載玻片，常規(guī)培養(yǎng)6 h后待細(xì)胞貼壁生長進(jìn)行分組及處理，同121，各孔設(shè)6個復(fù)孔，干預(yù)72 h后，將細(xì)胞爬片以4%多聚甲醛固定15 min，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)染色，于倒置生物顯微鏡下以DAB顯色并觀察。細(xì)胞漿或細(xì)胞核呈棕黃色為陽性著色，無陽性計0分；陽性細(xì)胞1%～30%計1分；陽性細(xì)胞31%～70%計2分；陽性細(xì)胞71%～100%計3分，據(jù)著色強度無、淺黃色、黃色、棕黃色依次計0、1、2、3分，免疫細(xì)胞化學(xué)評分（ICC評分）=陽性細(xì)胞比例評分×著色強度評分。實驗重復(fù)3次。

13統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 190統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較進(jìn)行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

21姜黃素對人胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖及凋亡的影響MTT檢測顯示，干預(yù)72 h后低/中/高劑量觀察組人胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖抑制率（%）分別為（459±132）、（4001±387）、（6098±597）；觀察組細(xì)胞增殖抑制率隨姜黃素作用濃度增加及干預(yù)時間延長逐漸升高（P<005）。見圖1。AnnexinV/FITC雙染法檢測顯示，干預(yù)72 h后對照組及低/中/高劑量觀察組人胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡率（%）分別為（814±125）、（1304±103）、（2715±162）、（5921±146）；觀察組細(xì)胞凋亡率高于對照組（P<005），且隨姜黃素作用濃度增加逐漸升高（P<005）。圖1人胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖情況

22姜黃素對人胰腺癌SW1990細(xì)胞βCatenin mRNA表達(dá)的影響干預(yù)72 h后對照組及低/中/高劑量觀察組人胰腺癌細(xì)胞βCatenin mRNA相對表達(dá)量分別為（097±010）、（080±009）、（043±011）、（021±008）。觀察組細(xì)胞βCatenin mRNA相對表達(dá)量較對照組降低（P<005），且隨姜黃素作用濃度增加逐漸降低（P<005）。見圖2。

23姜黃素對人胰腺癌SW1990細(xì)胞βCatenin蛋白表達(dá)的影響觀察組人胰腺癌SW1990細(xì)胞βCatenin蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)（Immunocytochemistry，ICC）評分高于對照組（P<005），且隨姜黃素作用濃度增大逐漸降低（P<005）。見表1。

3討論

胰腺癌是目前醫(yī)學(xué)界難以攻克的疾患之一，中醫(yī)藥在我國腫瘤的防治中有著悠久的歷史，其將胰腺癌歸屬于傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論中的“黃疸”“積聚”“伏梁”“痞塊”等范疇，主要病因為六淫邪毒侵襲，情志不暢等導(dǎo)致氣血津液運行不暢，臟腑功能失調(diào)，導(dǎo)致氣滯、血瘀、熱毒、痰濕等凝結(jié)于臟腑，日久積聚而成痞塊，故治療應(yīng)遵循清熱化濕、理氣散結(jié)原則。姜黃姜黃素是姜黃的主要化學(xué)成分，取自其根莖，姜黃味苦、辛，性溫，歸脾、肝經(jīng)，可入氣行氣散滯、活血化瘀等。姜黃素藥理學(xué)作用廣泛，如抗癌、抗氧化、抗炎、抗纖維化等，且具有毒性小、價廉、抗癌譜廣等優(yōu)勢。近年來其抗腫瘤作用受到關(guān)注，研究[8]報道，其對喉癌、乳腺癌、食管癌等具有顯著的治療效果；且體外研究[9]證實，姜黃素可對喉癌Hep2具有增殖抑制作用，且呈明顯時間劑量依賴性；蔡少鑫[10]研究報道，姜黃素可通過HIF1α抑制乳腺癌MDAMB453細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移；本研究中觀察組人胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡率高于對照組，且增殖抑制率、凋亡率隨姜黃素作用濃度增加逐漸升高，增殖抑制率亦隨干預(yù)時間延長逐漸升高，提示姜黃素對人胰腺癌細(xì)胞也有顯著的增殖抑制作用，并呈明顯的時間劑量依賴性。

姜黃素可直接作用于細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白及基因，調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號傳導(dǎo)通路，達(dá)到抗腫瘤的目的。楊芳等[11]研究報道，姜黃素抑制STAT3信號通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖。近年來研究[12]報道，Wnt信號通路異?；罨瘯?dǎo)致βcatenin積聚入核，活化下游靶基因，不僅可影響細(xì)胞增殖、分化障礙，還與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸、浸潤轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，參與多種腫瘤性疾病的發(fā)生。本研究中觀察組人胰腺癌SW1990細(xì)胞βCatenin mRNA相對表達(dá)量及βCatenin蛋白ICC評分低于對照組，且隨姜黃素作用濃度增加逐漸降低，提示姜黃素對人胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖抑制作用可能與其顯著下調(diào)βCatenin表達(dá)，抑制Wnt信號通路活化相關(guān)，有關(guān)姜黃素抗胰腺癌的其他作用機制仍需進(jìn)一步深入研究。

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