尚延春 申晟 柴巍巍 劉云龍

摘要目的：觀察當(dāng)歸拈痛湯對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠足趾關(guān)節(jié)的改變情況及探討其對(duì)滑膜細(xì)胞凋亡通路的影響。方法：選取50只Wistar雄性大鼠，并隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組；除對(duì)照組外其余均建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（Collagen Induced Arthritis，CIA）模型，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型制備成功后開(kāi)始給藥：對(duì)照組和模型組予以65 g/kg生理鹽水，低劑量組、中劑量組和高劑量組均為當(dāng)歸拈痛湯灌胃給藥，分別給予生藥65 g/kg，130 g/kg，195 g/kg。干預(yù)時(shí)間28 d。采用容積法測(cè)量雙后肢的足趾關(guān)節(jié)腫脹度；采用足趾關(guān)節(jié)蘇木精伊紅（HE）染色計(jì)算細(xì)胞凋亡數(shù)；采用免疫印跡法（Western Blotting，WB）檢測(cè)Bcl2、PI3K、Bax的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：對(duì)照組未見(jiàn)足趾腫脹情況，給藥1 d模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005），給藥7～28 d各劑量給藥組腫脹度均低于模型組（P<005），至14～28 d中、高劑量組的腫脹度顯著低于低劑量組（P<005），而28 d高劑量組的腫脹度又明顯低于中劑量組（P<005）。足趾關(guān)節(jié)HE染色中，對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組中的細(xì)胞凋亡數(shù)呈逐漸上升的趨勢(shì)（P<005）。PI3K和Bcl2蛋白在模型組中表達(dá)上調(diào)，經(jīng)過(guò)給藥治療，隨著劑量的逐漸升高而下調(diào)（P<005）；而B(niǎo)ax蛋白的表達(dá)情況則與PI3K相反，隨著劑量的增加而上調(diào)（P<005）。結(jié)論：當(dāng)歸拈痛湯能有效改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠足趾關(guān)節(jié)腫脹度，促進(jìn)滑膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡數(shù)進(jìn)而抑制滑膜細(xì)胞增殖的進(jìn)程，而PI3K通路對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控起到關(guān)鍵的作用。

關(guān)鍵詞滑膜；細(xì)胞凋亡；PI3K通路；當(dāng)歸拈痛湯；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；大鼠；足趾腫脹度

Experimental Study on Danggui Niantong Decoction in Treating Rheumatoid Arthritis Rats Based on the Apoptotic Pathway of Synovial Cells

Shang Yanchun， Shen Sheng， Chai Weiwei， Liu Yunlong

（Department of Knee Injury， Luoyang Zhenggu Hospital of Henan Province （Henan Orthopedic Hospital）， Zhengzhou 450000， China）

AbstractObjective：To observe the changes of the toe joint of the rats with rheumatoid arthritis （RA） and the effects on the expression of the apoptotic pathway of synovial cells.Methods：Except the control group， a total of 50 male Wistar rats were to establish collagen induced arthritis （collagen induced， arthritis， CIA） model， and randomly divided into model group， low dose group， middle dose group and high dose group； the medicine was given after rheumatoid arthritis model was successfully established.The control group and model group were given 65 g/kg normal saline， and low dose group， middle dose group and high dose group were given gavage Danggui Niantong Decoction of 65 13， 195， g/kg.The time of intervention was 28 days.The swelling degree of toe joints was measured by volumetric method， and the number of apoptotic cells was calculated by HE staining of toe joints， and the protein expression of Bcl2， PI3K and Bax was detected by Western blotting （WB）.Results：1）The control group had no toe swelling， compared with the drug 1 d model group， low dose group， middle dose group and high dose groups， there were without statistically significant difference （P>005）.The administration of the first 7 d28 d in each dosage group swelling degree was lower than the model group （P<005）.The swelling degree of the middle and high dose of 14 d28 d was significantly lower than that in low dose group （P<005）， and the high dose of 28 d group was higher than that of the swelling degree of the middle dose group （P<005）.2）In the HE staining of toe joints， the number of apoptotic cells in the control group， model group， low dose group， middle dose group and high dose group increased gradually （P<005）.3）WB detection showed that the expression of PI3K and Bcl2 in the model group was upregulated.After administration， the expression of Bax protein was decreased （P<005）， while the expression of Bax protein was opposite to that of PI3K， and increased with the increase of dose （P<005）.Conclusion：Danggui Niantong Decoction can effectively improve the joint swelling of rheumatoid arthritis rats， promote the apoptosis of synovial cells and inhibit the process of synovial cell proliferation， and the PI3K pathway plays a key role in the regulation of apoptosis.

Key WordsSynovial membrane； Apoptosis； PI3K pathway； Danggui Niantong Decoction； Rheumatoid arthritis； Rats； HE staining； Toe swelling degree

中圖分類號(hào)：R2894；R5932文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.039

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是臨床常見(jiàn)的自身免疫性疾病，滑膜組織炎癥反應(yīng)及關(guān)節(jié)破壞、畸形及功能喪失是其主要病理改變，給患者日常生活及工作造成嚴(yán)重影響[13]。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)并無(wú)特異性藥物對(duì)其進(jìn)行治療，多數(shù)靶向治療藥物雖可在一定程度改善RA臨床癥狀，但費(fèi)用高或不良反應(yīng)多嚴(yán)重影響治療依從性。RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”條目，歷代醫(yī)家均對(duì)痹證進(jìn)行大量條目的論述，風(fēng)濕熱痹是痹證的主要證候，素體脾胃虧虛致氣血不足，風(fēng)濕之邪乘虛而入蟄伏體內(nèi)，郁久化熱，濕熱交織壅堵骨節(jié)經(jīng)脈而發(fā)此病，故健脾益氣、祛風(fēng)清熱除濕是治療本病的關(guān)鍵[4]。當(dāng)歸拈痛湯首載于金代醫(yī)學(xué)家張?jiān)氐摹夺t(yī)學(xué)啟源》，是治療濕熱致痛的經(jīng)典名方，其在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎亦兼顧了病機(jī)，臨床不乏其療效的臨床報(bào)道[57]，但其作用機(jī)制目前尚無(wú)統(tǒng)一定論，我們制備RA模型大鼠，利用當(dāng)歸拈痛湯梯度干預(yù)，觀察療效差異及作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

11材料

111動(dòng)物選取50只的潔級(jí)雄性Wistar大鼠（由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重為（100±20）g，飼養(yǎng)條件室溫20 ℃、自由飲水飲食、通風(fēng)良好。

112藥物當(dāng)歸拈痛湯（當(dāng)歸15 g、羌活10 g、防風(fēng)10 g、升麻5 g、豬苓12 g、澤瀉10 g、茵陳10 g、陳皮10 g、黃芩10 g、葛根15 g、蒼術(shù)15 g、白術(shù)15 g、苦參10 g、知母10 g、甘草5 g、全蝎5 g、地龍15 g、黑豆15 g），所有中藥飲片由本院中藥房提供，經(jīng)過(guò)煎藥室水煎、抽濾、濃縮制作成200%的濃縮水煎藥液（1 mL約含164 g生藥）。

113試劑與儀器1）類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎造模試劑，產(chǎn)品：雞Ⅱ型膠原（CC II）和完全弗氏佐劑（CFA）均購(gòu)于Sigma公司。2）免疫印跡法（Western blotting，WB）試劑，產(chǎn)品：Bcl2鼠抗鼠單克隆抗體、PI3K鼠抗鼠單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠抗體均購(gòu)自Cell Signaling公司；而B(niǎo)ax、βactin兔抗鼠單克隆抗體則為福州沃森生物科技有限公司產(chǎn)品。3）凝膠成像系統(tǒng)SYSTEM GelDoc XR+（型號(hào)：1708195，中國(guó)BioRad公司）。

12方法

121分組與模型制備適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組即對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，除對(duì)照組，其余均建立在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（Collagen Induced Arthritis，CIA）大鼠模型上。CIA模型的建立：將CC Ⅱ溶解于01 mol/L冰醋酸中，并加入等體積的CFA充分乳化，最終配制出終濃度為05 mg/mL的乳劑，即Ⅱ型膠原溶液。根據(jù)03 mL/100 g的用量以10%水合氯醛麻醉大鼠后，將總量為1 mL的Ⅱ型膠原溶液皮下注射于大鼠背部及鼠尾根部多點(diǎn)，1周后上述方法、相同劑量再次皮下注射；對(duì)照組僅采用等體積的生理鹽水于相同位置皮下注射。

122干預(yù)方法在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型制備成功后開(kāi)始給藥：對(duì)照組和模型組給予65 g/kg生理鹽水，低劑量組、中劑量組和高劑量組均為當(dāng)歸拈痛湯灌胃給藥，分別給予生藥65，130，195 g/kg。干預(yù)時(shí)間28 d。

123檢測(cè)指標(biāo)與方法

1231足趾關(guān)節(jié)腫脹度容積法測(cè)量雙后肢的足腫脹度：計(jì)分法評(píng)價(jià)四肢足腫脹度：正常的足趾記為0分；僅有1個(gè)足趾關(guān)節(jié)腫脹記為1分；2個(gè)或超過(guò)2個(gè)足趾腫脹或1個(gè)踝關(guān)節(jié)腫脹變形記為2分；全部四肢的足趾關(guān)節(jié)腫脹記為3分。每只大鼠總記分0～12分。

1232足趾關(guān)節(jié)蘇木精伊紅（HE）染色治療28 d后，麻醉猝死大鼠后取其左前肢和右后肢近端第3足趾關(guān)節(jié)進(jìn)行固定，包埋切片后常規(guī)HE染色，在顯微鏡下凋亡細(xì)胞核于滑膜組織中呈深藍(lán)或青紫色，在400倍視野中計(jì)算每張切片的滑膜組織帶的細(xì)胞凋亡數(shù)，計(jì)數(shù)5～10個(gè)視野，取每個(gè)視野平均細(xì)胞凋亡數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1233免疫印跡法（Western blotting，WB）檢測(cè)治療28 d后麻醉猝死大鼠，取其后肢滑膜組織凍存-80 ℃保存，將剪碎滑膜組織加入蛋白裂解緩沖液中裂解，將堿性酮液及酚試劑加入所取上清液，根據(jù)BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)樣品濃度，并將樣品取等量上樣于濃縮膠中，經(jīng)十二烷基磺酸納聚丙烯酰胺凝膠

（SDSPAGE）電泳、聚偏氟乙烯（PVDF）膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉2 h后，一抗4 ℃孵育過(guò)夜[羊抗鼠Bcl2、PI3K及兔抗鼠Bax抗體（1∶200）、13actin鼠抗鼠抗體（1∶400）]，經(jīng)過(guò)3次磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗膜后，室溫孵育相應(yīng)堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗2 h，ECL堿性磷酸酶顯色，于凝膠自動(dòng)成像分析系統(tǒng)下成像，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析。進(jìn)行組間比較時(shí)則設(shè)對(duì)照組相對(duì)值為1。

13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 200統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊選擇LSDt或方差不齊選擇Tamhane ′s檢驗(yàn)，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

215組足趾腫脹度比較

對(duì)照組未見(jiàn)足趾腫脹情況，給藥1 d模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005），給藥7～28 d各劑量給藥組腫脹度均低于模型組（P<005），至14～28 d中、高劑量組的腫脹度顯著低于低劑量組（P<005），而給藥28 d高劑量組的腫脹度又明顯低于中劑量組（P<005）。

225組足趾關(guān)節(jié)HE染色比較

足趾關(guān)節(jié)HE染色中，對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組中的細(xì)胞凋亡數(shù)呈逐漸上升的趨勢(shì)（P<005）。見(jiàn)圖1。

23當(dāng)歸拈痛湯抑制滑膜細(xì)胞凋亡通路

WB檢測(cè)中顯示PI3K通路在模型組中表達(dá)上調(diào)，經(jīng)過(guò)給藥治療，隨著劑量的逐漸升高而下調(diào)（P<005）；Bcl2蛋白的改變情況同PI3K一致（P<005），而B(niǎo)ax蛋白的表達(dá)情況則與PI3K相反，隨著劑量的增加而上調(diào)（P<005）。見(jiàn)圖2。

而B(niǎo)cl2/Bax的比值中，假設(shè)對(duì)照組為1，則模型組比值最高，其次分別是低劑量組、中劑量組、高劑量組（P<005）。見(jiàn)表2。

3討論

RA以關(guān)節(jié)腫脹疼痛、活動(dòng)不利、晨僵為主要臨床特征，是病因復(fù)雜的自身免疫性疾病，具有易復(fù)發(fā)、病情纏綿難愈的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量及日常工作。非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑是目前臨床治療RA的主要藥物種類，雖可在一定程度上緩解病情，但耐受性差、不良反應(yīng)明顯，限制了患者的依從性，故探尋新的用藥方案具有重要價(jià)值。近年來(lái)，中草藥以其毒性低、療效顯著等特點(diǎn)被諸多醫(yī)學(xué)科研工作者納入研究。目前有多種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型，本研究采用膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型制備方法，經(jīng)過(guò)數(shù)十年的不斷驗(yàn)證已然成為研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎最重要的動(dòng)物模型之一，本研究研究顯示此方法制備而成的RA大鼠模型其足趾病理學(xué)表現(xiàn)及滑膜病理HE染色結(jié)果均與國(guó)內(nèi)外諸多文獻(xiàn)[810]結(jié)果相一致，這提示本研究的模型可行且造模成功。

RA屬于中醫(yī)“痹證”“歷節(jié)風(fēng)”范疇，歷代醫(yī)家對(duì)痹證”“歷節(jié)風(fēng)”研究方興未艾[11]。《黃帝內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為“痹證”與風(fēng)濕二邪的關(guān)系密切，當(dāng)痹證日久不愈則化熱成瘀，瘀阻脈絡(luò)耗氣傷津。清代醫(yī)家林佩琴在其《類證治裁·痹證論治》一書(shū)中描述：“久痹不愈，必有濕痰敗血瘀滯經(jīng)絡(luò)”。故素體虧虛，風(fēng)濕侵襲機(jī)體而成瘀阻，并貫穿本病發(fā)生發(fā)展過(guò)程，因此益氣活血，祛風(fēng)化濕通絡(luò)是治療本病的關(guān)鍵。當(dāng)歸拈痛湯源自《醫(yī)學(xué)啟源》，是治療濕熱致痛的經(jīng)典名方，方中重用羌活、茵陳，可祛風(fēng)勝濕，清熱利濕，共為君藥?！侗静菔斑z》中寫(xiě)到“茵陳可通關(guān)節(jié)，去滯熱”，故羌活、茵陳合用是疏風(fēng)清熱、化濕止痛經(jīng)典組合。豬苓、澤瀉是利水滲濕的要藥，黃芩、苦參可清熱燥濕；防風(fēng)、升麻及葛根解表疏風(fēng)。上述幾味中藥分別從“濕”“風(fēng)”“熱”方面進(jìn)行治療。白術(shù)、蒼術(shù)為佐藥可燥濕健脾，運(yùn)化水濕以祛邪。RA多以濕邪為勝，藥方中諸藥多以祛濕為主，藥性以苦燥為著，極易耗血傷陰，故加黨參、當(dāng)歸以益氣生血，知母清熱養(yǎng)陰，達(dá)到祛邪不傷正的目的。方中甘草可調(diào)和諸藥藥性?？v觀整方藥物配伍，具有發(fā)散風(fēng)濕與利濕清熱相配，表里共治；苦燥滲利兼顧益氣養(yǎng)血，祛邪而不傷正[1213]。本研究結(jié)果顯示加用當(dāng)歸拈痛湯的大鼠不論是在改善足腫脹度方面還是病理學(xué)方面均明顯優(yōu)于模型組，這提示當(dāng)歸拈痛湯確對(duì)RA有理想療效，并具有一定的劑量依賴性。

目前雖對(duì)RA的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一定論，但有研究顯示RA化膜細(xì)胞以自分泌或旁分泌的形式分泌大量活性因子，各類活性因子間相互作用后形成復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)滑膜細(xì)胞的增殖及凋亡過(guò)程，有研究人員指出，滑膜細(xì)胞增殖/凋亡過(guò)程的失衡是RA發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，誘導(dǎo)其凋亡是控制病情的關(guān)鍵。由此我們考慮當(dāng)歸拈痛湯可有效治療RA是否與介導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡程序有關(guān)，并進(jìn)一步研究。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)研究不斷深入，各類細(xì)胞因子及其相關(guān)受體介導(dǎo)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡等一系列過(guò)程已被不斷證實(shí)，其中PI3K/AKT通路與細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切，成為研究重點(diǎn)。PI3K/AKT信號(hào)通路的異常激活是滑膜細(xì)胞凋亡失衡的機(jī)制之一[1415]，因此我們認(rèn)為從PI3K/AKT信號(hào)通路研究當(dāng)歸拈痛湯的作用機(jī)制具有理論可行性。于靜雅和陳勇[15]發(fā)現(xiàn)PI3K在RA滑膜細(xì)胞中具有高表達(dá)，活化的PI3K可激活A(yù)KT，從而介導(dǎo)多種下游蛋白的磷酸化，抑制細(xì)胞凋亡。PI3K可展現(xiàn)出絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，又具有磷脂酰肌醇激酶的活性，對(duì)G蛋白有活化效應(yīng)，其水平上調(diào)后可活化下游因子AKT，抑制諸多凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。本研究中當(dāng)歸拈痛湯干預(yù)的大鼠滑膜組織PI3K水平下調(diào)，促進(jìn)了凋亡程序的啟動(dòng)。我們對(duì)Bcl2及Bax2個(gè)細(xì)胞因子進(jìn)一步檢測(cè)，Bcl2家族是細(xì)胞凋亡程序的“開(kāi)關(guān)分子”，Bcl2與Bax的水平變化決定著細(xì)胞的命運(yùn)，Bcl2是抗細(xì)胞凋亡的重要因子，Bax水平上調(diào)是促進(jìn)了細(xì)胞凋亡[1617]，Bcl2與Bax均在細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及線粒體膜有廣泛分布，當(dāng)Bcl2表達(dá)下調(diào)或Bax水平增加時(shí)可改變線粒體的孔道形態(tài)，導(dǎo)致其通透性增加，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，Bcl2與Bax表達(dá)改變誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡被研究人員視為“內(nèi)源性途徑”改變細(xì)胞命運(yùn)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠Bcl2水平明顯上調(diào)，Bax表達(dá)被抑制，提示RA模型大鼠的滑膜組織中的滑膜細(xì)胞凋亡被抑制，從而導(dǎo)致其增殖能力凸顯，滑膜細(xì)胞的過(guò)度增殖導(dǎo)致了關(guān)節(jié)軟骨和骨組織浸潤(rùn)生長(zhǎng)，從而出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形功能下降。當(dāng)歸拈痛湯干預(yù)后大鼠滑膜組織的Bcl2水平下調(diào)，Bax表達(dá)增加，可見(jiàn)該湯劑可有效誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡，改善病情。

總之，我們證實(shí)了當(dāng)歸拈痛湯確對(duì)RA有理想療效，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡有關(guān)，從而抑制了滑膜細(xì)胞向關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的過(guò)度增殖，改善了RA的病情。

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（2018-01-26收稿責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）