余小蘭　鄒立飛　鄒雨坤　李光義　李曉亮　李勤奮

摘要：【目的】篩選對(duì)甜瓜枯萎病菌有較強(qiáng)拮抗活性的菌株，并對(duì)拮抗菌株進(jìn)行分類鑒定，為豐富熱帶地區(qū)甜瓜枯萎病生防菌資源庫(kù)及田間應(yīng)用提供參考?！痉椒ā恳郧捌诤Y選獲得的82株菌株為試驗(yàn)材料，通過(guò)平板對(duì)峙、繼代培養(yǎng)、發(fā)芽率及盆栽試驗(yàn)篩選出對(duì)甜瓜枯萎病菌有較強(qiáng)拮抗活性的菌株，并通過(guò)形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析對(duì)篩選獲得的菌株進(jìn)行分類鑒定?！窘Y(jié)果】篩選出一株對(duì)甜瓜枯萎病菌有較強(qiáng)拮抗活性的放線菌菌株D2，其對(duì)枯萎病的防治效果達(dá)73.53%。D2菌株可形成氣生菌絲和孢子絲，孢子絲呈螺旋形，孢子卵呈圓形，且與利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus）聚于同一分支中，其同源性達(dá)99.6%；綜合D2菌株的形態(tài)特征及生理生化特性，可鑒定其為利迪鏈霉菌（S. lydicus）?！窘Y(jié)論】D2菌株對(duì)甜瓜枯萎病有較好的防治效果，具有開發(fā)成生物農(nóng)藥或生物肥料的潛力。

關(guān)鍵詞： 甜瓜枯萎??；拮抗菌；篩選；鑒定；熱帶地區(qū)

中圖分類號(hào)： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）06-1118-07

Abstract：【Objective】Antagonistic bacteria with strong antagonistic effect to fusarium wilt of melon was screened and identified to provide reference for enriching the resources of biocontrol bacteria against melon fusarium wilt in tropical zone. 【Method】Eighty-two strains obtained in preliminary screening were used as experimental material， and antagonistic bacteria against melon fusarium wilt were screened by using plate confront culture， successive transfer culture， germination experiment and pot experiment.The strains were classified through characteristics in morphology， physiology and biochemistry and information of 16S rDNA. 【Result】A strain of actinomycetes D2 with strong antagonistic effect to melon fusarium wilt was screened and it had 73.53% control efficiency to fusarium wit of muskmelon. Strain D2 would form aerial hyphae and fibrillae of spores， and fibrillae of spores were spiral， and spore eggs were round. Strain D2 and Streptomyces lydicus were clustered in the same branch with 99.6% homology. Taking the morphological characters and physiological and biochemical characters of strain D2 into consideration， strain D2 was finally identified as S. lydicus. 【Conclusion】Strain D2 has strong antagonistic effect to fusarium wilt of melon and worth to be developed as biological pesticides and fertilizers.

Key words： melon fusarium wilt； antagonistic bacteria； screening； identification； tropical zone

0 引言

【研究意義】甜瓜是我國(guó)廣泛栽種的經(jīng)濟(jì)作物之一（張永平等，2017），據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒數(shù)據(jù)顯示，2016年我國(guó)甜瓜種植面積超過(guò)48萬(wàn)ha，產(chǎn)量達(dá)1570萬(wàn)t；海南省2016年甜瓜種植面積為2823 ha，產(chǎn)量5.69萬(wàn)t。在甜瓜種植面積、產(chǎn)量和效益穩(wěn)步上升的同時(shí)，甜瓜土傳病害尤其是枯萎病日益嚴(yán)重，極大地限制了甜瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前，防治甜瓜枯萎病的主要途徑有化學(xué)藥劑防治（周小林等，2007；楊長(zhǎng)成等，2010；張靜和胡立勇，2012；?zbah?e et al.，2014）、種植抗病品種（王雙伍等，2010）、農(nóng)業(yè)措施（李瑞琴，2004；Egamberdiyeva et al.，2004；尹守恒等，2012）及生物防治（李旭等，2014；Madadkhah et al.，2014）等。化學(xué)藥劑對(duì)枯萎病有一定防效，但易使枯萎病病原菌產(chǎn)生抗藥性，造成甜瓜果實(shí)安全隱患。生物防治因生態(tài)環(huán)保且經(jīng)濟(jì)投入較少而受到人們的廣泛關(guān)注（Cao et al.，2016）。因此，挖掘甜瓜枯萎病的生防菌資源，對(duì)甜瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)甜瓜枯萎病的生物防治進(jìn)行了研究，已報(bào)道的能有效抑制鐮刀菌而防治枯萎病的生防菌株有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）（黃建鳳等，2016；李歡等，2017）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）（孫廣正等，2015）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）（Ainhoa et al.，2009；Gava and Pinto，2016）、草酸青霉（Penicillium oxalicum）（Cal et al.，2009；白飛榮等，2014）、多粘類芽孢桿菌（GenBank accession number GQ849013）（趙青云，2011）、放線菌S14（鄒立飛，2013；姚輝，2014）等。黃艷青等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，接種木霉菌（Trichoderma spp.）制劑T23和Ta22可顯著抑制甜瓜枯萎病的發(fā)生，且相對(duì)防效可達(dá)79%。牛夢(mèng)天（2016）從土壤、微生物菌劑及生物肥料中篩選出對(duì)黃瓜枯萎病有較高抑制效果的多粘芽孢桿菌D1和解淀粉芽孢桿菌D3，其抑菌圈直徑均大于3 cm。李晨楚等（2017）篩選出一株枯草芽孢桿菌B43，該拮抗菌對(duì)香蕉枯萎病有較好的防治效果。【本研究切入點(diǎn)】目前，針對(duì)我國(guó)熱帶地區(qū)甜瓜枯萎病生物防治的研究較少，有效的生防菌資源非常有限，且已報(bào)道的枯萎病生防菌多為細(xì)菌和真菌，因而有必要分離篩選更多不同類型的微生物功能菌?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)本課題組前期篩選獲得的可對(duì)甜瓜枯萎病菌產(chǎn)生抑菌帶的82株菌株進(jìn)行平板對(duì)峙、繼代培養(yǎng)、發(fā)芽率及盆栽試驗(yàn)，并通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特性、16S rDNA序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行鑒定，以期為熱帶地區(qū)甜瓜枯萎病生防制劑研發(fā)提供菌種資源，為有效控制甜瓜枯萎病提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試枯萎病菌：由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)農(nóng)業(yè)研究中心保存。供試拮抗菌：從海南省11個(gè)縣（市、地區(qū)）露地栽培的厚皮甜瓜根際土壤中分離獲得，共82株菌株，保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)農(nóng)業(yè)研究中心。甜瓜品種：南海蜜。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 拮抗菌篩選

1. 2. 1. 1 平板對(duì)峙試驗(yàn) 以甜瓜枯萎病菌為指示菌，對(duì)供試82株菌株進(jìn)行平板對(duì)峙試驗(yàn)，計(jì)算拮抗菌的拮抗指數(shù)。拮抗指數(shù)=（抑菌圈半徑-拮抗菌半徑）/拮抗菌半徑

1. 2. 1. 2 繼代培養(yǎng)試驗(yàn) 以拮抗指數(shù)變化為依據(jù)，對(duì)平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選獲得的拮抗菌進(jìn)行室內(nèi)繼代培養(yǎng)，從而篩選出對(duì)甜瓜枯萎病菌拮抗作用能穩(wěn)定遺傳的菌株。

1. 2. 1. 3 種子發(fā)芽率試驗(yàn) 將繼代培養(yǎng)試驗(yàn)篩選獲得的拮抗菌株制成菌懸液進(jìn)行甜瓜種子發(fā)芽率試驗(yàn)，以未添加拮抗菌的培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理50粒種子，重復(fù)3次。種子處理方法：將飽滿且大小一致的甜瓜種子放入10% H2O2溶液中消毒5 min，用蒸餾水清洗2～3次后放入菌懸液中浸泡2 h，取出種子均勻置于鋪有濕潤(rùn)無(wú)菌濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中，30 ℃培養(yǎng)36 h后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)，計(jì)算種子發(fā)芽率。

1. 2. 1. 4 盆栽防效試驗(yàn) 選擇拮抗效果較好的菌株（D1、D2和H3）作為拮抗菌，以甜瓜枯萎病菌為試驗(yàn)病原菌，進(jìn)行甜瓜枯萎病防治效果盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)19個(gè)處理，每處理9盆，每盆種植甜瓜1株，接菌量均為10 mL/株，3次重復(fù)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。甜瓜枯萎病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照相關(guān)文獻(xiàn)（李瑞琴，2004）。

1. 2. 2 拮抗菌鑒定及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析 拮抗菌的形態(tài)觀察及生理生化測(cè)定方法參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（Buchanan and Gibbons，1995）。拮抗菌的16S rDNA測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析：菌株16S rDNA引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增參照Sambrook和Russell（2002）、鄒立飛（2013）的方法。PCR反應(yīng)體系50.0 ?L：濃縮反應(yīng)緩沖液5.0 ?L，dNTP混合物（0.2 mol/L）1.0 ?L，Tap DNA聚合酶0.5 ?L，氯化鎂（1.5 mol/L）5.0 ?L，上、下游引物（1 ?mol/L）各1.0 ?L，DNA模板1.0 ?L，無(wú)菌水35.5 ?L。測(cè)序分析：將測(cè)得的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行相似性檢索，在MEGA7.0中采用ClustalW將拮抗菌及其同源序列對(duì)齊，進(jìn)而構(gòu)建Neighbor-Joining進(jìn)化樹，分析拮抗菌與其他已報(bào)道菌株間的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2. 1 拮抗菌篩選結(jié)果

2. 1. 1 平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，在初篩得到的82株菌株中，拮抗指數(shù)>2.00的菌株有9株，其拮抗指數(shù)排序?yàn)镈2>D3>H5=H3>D1>H6>H20>H7>H2。

2. 1. 2 繼代培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)2.1.1中篩選獲得的9株菌株D2、D3、H5、H3、D1、H6、H20、H7和H2進(jìn)行繼代培養(yǎng)，各菌株子代拮抗病原菌能力如圖1所示。由圖1可知，各菌株隨著繼代數(shù)的增加，其拮抗能力逐漸下降，當(dāng)經(jīng)歷到20代時(shí)，只有D1、D2、H3、H5和H6菌株對(duì)病原菌仍有一定的拮抗作用，故可判定D1、D2、H3、H5和H6菌株對(duì)甜瓜枯萎病菌的拮抗性遺傳較穩(wěn)定，有利于拮抗菌在生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用中持續(xù)發(fā)揮拮抗作用。

2. 1. 3 種子發(fā)芽率試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)菌株D1、D2、H3、H5和H6處理后的甜瓜種子發(fā)芽率結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，經(jīng)菌株D1、D2和H3處理后的甜瓜種子發(fā)芽率分別為86.7%、93.3%和94.4%，與CK的種子發(fā)芽率（90.0%）差異不顯著（P>0.05），故可判定D1、D2和H3菌株不影響甜瓜種子發(fā)芽。因此，選擇D1、D2和H3菌株為盆栽防效試驗(yàn)菌，研究其對(duì)甜瓜枯萎病的防治效果。

2. 1. 4 盆栽防效試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，經(jīng)D2菌株處理的甜瓜發(fā)病情況均輕于D1和H3菌株處理，其中D2-6處理的甜瓜發(fā)病最輕，其對(duì)枯萎病的防效達(dá)73.53%，故相對(duì)于D1和H3菌株，D2菌株拮抗甜瓜枯萎病效果最好。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，先接種拮抗菌后接種病原菌的處理D1-4、D1-5、D1-6、D2-4、D2-5、D2-6、H3-4、H3-5和H3-6，其病情指數(shù)均低于先接種病原菌后接種拮抗菌的處理，說(shuō)明在前期使用拮抗菌預(yù)防甜瓜枯萎病的效果更佳。

2. 2 拮抗菌鑒定結(jié)果

同步平板對(duì)峙試驗(yàn)、繼代培養(yǎng)、發(fā)芽率試驗(yàn)及盆栽試驗(yàn)均顯示D2菌株對(duì)甜瓜枯萎病菌的防治效果最佳，故對(duì)D2菌株進(jìn)行分析鑒定。由圖3可知，D2菌株可形成氣生菌絲和孢子絲，孢子絲呈螺旋形，孢子卵呈圓形。從圖4可看出，D2菌株與Streptomyces lydicus NBRC 13058T（AB184281）和S.chattanoogensis DSM 40002T（AJ621611）的親緣關(guān)系最近，且在NBCI的比對(duì)中其同源性分別達(dá)99.6%和99.5%。由D2菌株的形態(tài)特征（表4）及生理生化特性（表5）比對(duì)可知，D2菌株與S. lydicus NBRC 13058T（AB184281）、S. chattanoogensis DSM 40002T（AJ621611）、S. sioyaensis NRRL B-5408T（DQ026654）、S. albofaciens JCM 4342T（AB045880）和S.chrestomyceticus DSM 40545T（AJ621609）等菌株親緣關(guān)系較近。綜上所述，鑒定D2菌株為利迪鏈霉菌（S. lydicus）。

3 討論

放線菌分布廣泛，自1877年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其產(chǎn)生的活性物質(zhì)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域，為人類做出了巨大貢獻(xiàn)（黃亞麗等，2005）。目前，放線菌的分類需綜合化學(xué)分類和分子分類等多種分類方法方能確定其精確位置（Hffrench et al.，2007；張茹萍，2011；陸丹丹，2016；田慧，2017）。本研究首先采用經(jīng)典分類方法（形態(tài)及生理生化特征）鑒定D2菌株，發(fā)現(xiàn)該菌株具有典型的鏈霉菌屬形態(tài)特征；隨后通過(guò)16S rDNA測(cè)序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)D2菌株與利迪鏈霉菌聚于同一分支中，其同源性達(dá)99.6%。D2菌株能使明膠液化、牛奶凝固胨化，能利用葡萄糖、果糖、甘露醇，不能使淀粉水解、硝酸鹽還原，不產(chǎn)生硫化氫和黑色素，不能利用木糖和淀粉；而利迪鏈霉菌能使淀粉水解，能利用木糖，弱利用淀粉。由此推測(cè)，D2菌株與利迪鏈霉菌可能屬于不同的種，但目前尚不能判定D2菌株是否為利迪鏈霉菌的一個(gè)新種，需要通過(guò)與模式種的DNA雜交后進(jìn)一步分析。

隨著研究的深入，近年來(lái)放線菌對(duì)植物病害的防治作用也逐漸被人們發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)。周婧等（2008）從黃瓜、南瓜和甜瓜的根際土壤中篩選到一株生防菌H-5，其對(duì)溫室甜瓜枯萎病的防效達(dá)75.6%。沈文淵（2012）對(duì)黃瓜、冬瓜、西瓜和苦瓜枯萎病進(jìn)行生物防治研究，篩選出放線菌14號(hào)對(duì)上述4種瓜類枯萎病的抑制率分別為72.11%、70.09%、54.27%和56.41%。梁銀等（2013）從南京紫金山麓土壤中分離篩選出一株放線菌，其對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果為51.85%。呂超（2015）對(duì)不同西瓜連作地塊進(jìn)行生防處理，發(fā)現(xiàn)接種放線菌Act1可顯著降低連作大棚西瓜枯萎病的發(fā)病率。莊令（2017）從90株深海鏈霉菌中篩選出24株對(duì)香蕉枯萎病菌具有拮抗活性的菌株，活性率高達(dá)26.7%，其中菌株220362的拮抗活性強(qiáng)、嗜鹽性高，產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)穩(wěn)定，初步鑒定為鏈霉菌屬的1個(gè)新種。本研究篩選獲得的D2菌株對(duì)甜瓜枯萎病的最高防效可達(dá)73.53%，與上述報(bào)道的防治效果基本一致。

目前，報(bào)道較多可用于防治甜瓜枯萎病的微生物主要有細(xì)菌（莊敬華等，2008；趙青云，2011；黃建鳳等，2016）和真菌（黃艷青等，2009；Ainhoa et al.，2009；白飛榮等，2014），而本研究篩選獲得的D2菌株屬于放線菌，對(duì)于豐富枯萎病生防菌資源庫(kù)及利用放線菌防治甜瓜枯萎病有重要指導(dǎo)意義。另外，利迪鏈霉菌能產(chǎn)生許多次生代謝產(chǎn)物，如利迪霉素（Lydimycin）、利迪鏈菌素（Streptolydigin）和蘋果酸氧霉素（Malioxamycin）等抗生素（張致平和姚天爵，2005；石玲玲等，2017），其對(duì)細(xì)菌和真菌的繁殖有極大抑制作用。同時(shí)，在利迪鏈霉菌發(fā)酵液所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)中，涉及到的酶多為β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶，其中以β-1，3-葡聚糖酶研究較多（Liu and Balasubramanian，2001；陳懇，2016）。β-1，3-葡聚糖酶能分解真菌細(xì)胞壁中的葡聚糖，從而使細(xì)胞壁厚度變薄，導(dǎo)致細(xì)胞壁暴露，致使細(xì)胞因滲透壓差而導(dǎo)致死亡（Georgopapadakou，2001）。本研究?jī)H對(duì)D2菌株對(duì)甜瓜枯萎病抑制效果進(jìn)行初步研究，下一步將對(duì)D2菌株規(guī)模化培養(yǎng)條件、抑菌活性物質(zhì)鑒定及田間應(yīng)用進(jìn)行探索，從而為利用該菌開發(fā)新的生物農(nóng)藥或生物肥料提供技術(shù)指導(dǎo)。

4 結(jié)論

本研究篩選出一株對(duì)甜瓜枯萎病菌有較強(qiáng)拮抗活性的放線菌D2菌株，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析，確定D2菌株為利迪鏈霉菌（S. lydicus），該放線菌對(duì)甜瓜枯萎病有較好的防治效果，具有開發(fā)成生物農(nóng)藥或生物肥料的潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）