韓雪 柴金苗 李欽青 王永輝

中圖分類號 R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）09-1245-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.22

摘 要 目的：初步擬定蛇床子搽劑（簡稱為“搽劑”）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：觀察搽劑的性狀，采用薄層色譜法對搽劑中蛇床子素進(jìn)行定性鑒別并對搽劑的相對密度、含醇量和pH值等進(jìn)行測定，采用高效液相色譜法對搽劑中蛇床子素和歐前胡素進(jìn)行定量分析。結(jié)果：3批樣品均為紅棕色液體，氣香。在供試品薄層色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上顯現(xiàn)出相同顏色的熒光斑點(diǎn)。蛇床子素和歐前胡素檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.101 2～0.910 8、0.006 2～0.124 4 mg/L（r均為0.999 6），精密度試驗(yàn)的RSD分別為1.38%、0.79%（n=6），穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD分別為0.33%、0.41%（n=6），重復(fù)性試驗(yàn)的RSD分別為0.83%、1.98%（n=6），平均加樣回收率分別為98.73%、99.25%（RSD分別為1.29%、1.22%，n=6）；含量測定結(jié)果顯示，3批樣品中蛇床子素含量為2.20～2.35 mg/mL，歐前胡素為0.310～0.340 mg/mL。結(jié)論：建立的方法操作簡單、快速、準(zhǔn)確，可用于蛇床子搽劑的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 蛇床子搽劑；薄層色譜法；蛇床子素；歐前胡素；高效液相色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

ABSTRACT OBJECTIVE： To formulate the quality standard of Cnidium monnieri liniment （called “l(fā)iniment” for short） preliminarily. METHODS： The property of liniment was observed. TLC was used for qualitative identification of osthole in liniment； relative density， alcohol content and pH value were also determined. The osthole and imperatorin in liniment were analyzed qualitatively by HPLC. RESULTS： 3 batch of samples were reddish brown liquid and fragrant smelling. In TLC of test sample，the same color fluorescent spots were found in corresponding position as chromatogram of control sample. The linear range of osthole and imperatorin were 0.101 2-0.910 8 （r=0.999 6） and 0.006 2-0.124 4 mg/L （r=0.999 6）. RSDs of precision tests were 1.38% and 0.79% （n=6）. RSDs of stability tests were 0.33% and 0.41% （n=6）. RSDs of reproducibility tests were 0.83% and 1.98% （n=6）， respectively. Average recoveries rate were 98.73% （RSD=1.29%，n=6） and 99.25% （RSD=1.22%，n=6）. Results of content determination showed that the content of osthole and imperatorin were 2.20-2.35 mg/mL and 0.310-0.340 mg/mL，respectively. CONCLUSIONS： Established method is simple， rapid， accurate and can be used for quality control of C. monnieri liniment.

KEYWORDS Cnidium monnieri liniment； TLC； Osthole； Imperatorin； HPLC； Quality standard

蛇床子為傘形科植物蛇床的干燥果實(shí)，味辛、苦，性溫，具有溫腎壯陽、祛風(fēng)燥濕的功效。蛇床子及其制劑在臨床上已應(yīng)用多年，包括散劑、軟膏、洗劑、酊劑等，主要用于治療濕疹等各種瘙癢性疾病[1-7]。蛇床子的有效化學(xué)成分主要為香豆素類化合物，包括蛇床子素、歐前胡素等[8]，其中具有較強(qiáng)活性的單體成分為蛇床子素，其含量為蛇床子的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一[9-11]。蛇床子作為常用外用藥，一般采用傳統(tǒng)煎煮法進(jìn)行提取[12]。已有的研究表明，以水提法提取蛇床子其有效成分的提取率很低[13]。另有研究表明，蛇床子止癢的有效成分主要為其醇提取物和揮發(fā)油[14]，并且采用醇提蛇床子素的提取效果最優(yōu)[15]。因此，為了更利于蛇床子素等脂溶性有效成分的提取，筆者改變了傳統(tǒng)的提取方法，選用乙醇作為提取溶劑制備了蛇床子搽劑。為更好地保證該制劑的療效，控制蛇床子搽劑的內(nèi)在質(zhì)量，筆者采用薄層色譜法對蛇床子搽劑進(jìn)行定性鑒別，同時(shí)對其相對密度、含醇量及pH值等進(jìn)行測定，并建立同時(shí)測定蛇床子搽劑中蛇床子素和歐前胡素兩種組分的高效液相色譜方法，初步擬定蛇床子搽劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料

1.1 儀器

Waters E2695高效液相色譜儀，包括e2695分離單元、2998二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；FB224自動內(nèi)校電子分析天平（上海舜禹恒平科學(xué)儀器有限公司）；AB135-S十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；PHS-3C+經(jīng)濟(jì)型酸度計(jì)（成都世紀(jì)方舟科技有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

蛇床子藥材（產(chǎn)地：安徽）購自河北省安國中藥材市場，由山西中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室王兵老師鑒定為真品；蛇床子搽劑（山西中醫(yī)藥大學(xué)自制，批號分別為：20170311、20170312、20170313，規(guī)格：50 mL/瓶）；蛇床子對照品（批號：110822-201609，純度：100%）、歐前胡素對照品（批號：110826-201415，純度：98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，乙醇、甲苯、乙酸乙酯、正己烷等均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 蛇床子搽劑的制備

取蛇床子藥材200 g，粉碎成中粉，加入75%乙醇 1 100 mL，浸漬24 h，然后以3 mL/min滲漉提取，收集濾液，濾液加75%乙醇調(diào)整至1 000 mL，濾過，即可。

2.2 性狀

取本品3批（批號：20170311、20170312、20170313）進(jìn)行性狀觀察。結(jié)果，3批樣品均為暗棕紅色的液體，氣香。

2.3 蛇床子素定性鑒別

取本品3批（批號：20170311、20170312、20170313），作為供試品溶液；另取蛇床子素對照品適量，用無水乙醇制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液；另取75%乙醇，作為陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）通則0502法[10]進(jìn)行薄層色譜鑒別，分別吸取上述5個(gè)溶液各0.5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-正己烷（3 ∶ 3 ∶ 2，V/V/V）為展開劑展開，取出，晾干，置于紫外燈（365 nm波長）下檢視。結(jié)果，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照溶液無干擾，結(jié)果見圖1。

2.4 相對密度

分別取本品3批（批號：20170311、20170312、2017- 0313），參考2015年版《中國藥典》（四部）通則0601中比重瓶法[10]進(jìn)行測定。結(jié)果，3批樣品的相對密度分別為0.89、0.89、0.88，暫定蛇床子搽劑的相對密度為0.85～0.93。

2.5 含醇量

分別取本品3批（批號：20170311、20170312、2017- 0313），參考2015年版《中國藥典》（四部）通則0711中第二法——蒸餾法[10]進(jìn)行測定。結(jié)果，3批樣品的含醇量分別為69%、70%、70%，暫定蛇床子搽劑的含醇量為65%～75%。

2.6 pH值

分別取本品3批（批號：20170311、20170312、2017- 0313），參考2015年版《中國藥典》（四部）通則0631項(xiàng)下方法[10]測定。結(jié)果，3批樣品的pH值分別為6.20、6.17、6.20，暫定蛇床子搽劑的 pH值為6.0～6.5。

2.7 蛇床子素、歐前胡素含量測定

2.7.1 色譜條件 色譜柱：Waters C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（65 ∶ 35，V/V）等度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：320 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 ?L。

2.7.2 對照品溶液的制備 （1）蛇床子素對照品溶液：取蛇床子素對照品適量，精密稱定，加無水乙醇制成質(zhì)量濃度為0.506 mg/mL的對照品貯備液；精密量取1 mL貯備液于10 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度約0.050 6 mg/mL的對照品溶液。（2）歐前胡素對照品溶液：取歐前胡素對照品適量，精密稱定，加無水乙醇制成質(zhì)量濃度為0.311 mg/mL的對照品貯備液；精密量取1 mL貯備液于10 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度約0.031 1 mg/mL的對照品溶液。

2.7.3 供試品溶液的制備 精密量取本品2 mL，置于25 mL量瓶中，加75%乙醇稀釋至刻度，搖勻，然后以 離心半徑為6 cm、6 000 r/min離心10 min，收集上清液。精密量取上清液5 mL，加75%乙醇稀釋，定容，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.7.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“2.7.2”項(xiàng)下對照品溶液、“2.7.3”項(xiàng)下供試品溶液以及空白溶液（75%乙醇），分別按“2.7.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄色譜。結(jié)果，空白溶液對蛇床子素和歐前胡素測定無干擾，相鄰峰間分離度大于1.5，按蛇床子素和歐前胡素計(jì)理論板數(shù)均在5 000以上。色譜圖見圖2。

2.7.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.7.2”項(xiàng)下對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻。按照“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行回歸分析，得蛇床子素的回歸方程為y=326 724x+1 678（r=0.999 6），歐前胡素的回歸方程為y=3.33×106x+41 313（r=0.999 6）。結(jié)果表明，蛇床子素和歐前胡素檢測分別在質(zhì)量濃度為0.101 2～0.910 8、0.006 2～0.124 4 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.7.2”項(xiàng)下對照品溶液10 μL，在“2.7.1”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測得歐前胡素和蛇床子素峰面積的RSD分別為1.38%、0.79%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.7.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號：20170311），在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h后分別按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果，歐前胡素和蛇床子素峰面積的RSD分別為0.33%、0.41%（n=7），表明供試品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（批號：20170311）2 mL，共6份，按“2.7.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，再按“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，歐前胡素和蛇床子素峰面積的RSD分別為0.83%、1.98%（n=6），表明重復(fù)性良好。

2.7.9 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密量取已知蛇床子素含量（0.451 mg/mL）和已知含量歐前胡素含量（為0.056 mg/mL）的供試品（批號均為20170311）溶液2 mL，分別置于25 mL量瓶中，加入蛇床子素對照品溶液（0.45 mg/mL）或歐前胡素對照品溶液（0.056 mg/mL）2 mL，然后分別加入75%乙醇至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液，平行制備6份。然后按照“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積并計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果，蛇床子素、歐前胡素的平均加樣回收率分別為98.73%、99.25%，RSD分別為1.29%、1.22%（n=6），表明儀器準(zhǔn)確度較好。

2.7.10 樣品含量測定 分別精密吸取3批供試品溶液和2種對照品溶液各10 μL ，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以外標(biāo)法計(jì)算樣品中蛇床子素和歐前胡素含量。結(jié)果，批號為20170311的樣品溶液中蛇床子素和歐前胡素的含量分別為2.25、0.325 mg/mL；批號為20170312的樣品溶液中蛇床子素和歐前胡素的含量分別為2.35、0.340 mg/mL；批號為20170313的樣品溶液中蛇床子素和歐前胡素的含量分別為2.20、0.310 mg/mL。

3 討論

蛇床子是治療多種皮膚病的最常用藥物之一，臨床多以外用為主，在治療瘙癢癥的諸多復(fù)方中，蛇床子亦為主藥。中藥成方制劑中含蛇床子的制劑多為熏洗方，且蛇床子的提取方式多為煎煮法或水提醇沉法。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[16]，蛇床子素可以抑制組胺引起的瘙癢，其作用機(jī)制為調(diào)節(jié)與組胺依賴性瘙癢相關(guān)的離子通道，但水提物無顯著止癢效果[17]。在前期研究中，筆者以蛇床子素為主要篩選指標(biāo)，對提取方式、溶劑濃度、溶劑用量等因素進(jìn)行了考察，同時(shí)綜合考慮工業(yè)生產(chǎn)效率與提取成本的影響，最終確定以75%乙醇作為提取溶劑進(jìn)行提取。考慮到所分析生物堿類物質(zhì)的極性較強(qiáng)，水溶性較好，以及在色譜柱上的保留問題，筆者在預(yù)試驗(yàn)中嘗試了不同類型（Waters、Agilent、Thermo）的色譜柱，結(jié)果Waters色譜柱對生物堿類化合物的保留和分離效果更好。

搽劑是藥材提取物、藥材細(xì)粉或揮發(fā)性藥物用乙醇、水或適宜的溶劑制成的澄清或混懸的外用液體制劑。本研究按照2015年版《中國藥典》（四部）1107搽劑制劑通則的要求[10]，對蛇床子搽劑的相對密度、pH值和乙醇量均進(jìn)行了考察，可為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。本研究中蛇床子素的鑒別參考了藥典中蛇床子的分析方法進(jìn)行薄層展開，結(jié)果所得斑點(diǎn)較為清晰，陰性無干擾，專屬性較強(qiáng)，方法可行，但其有效成分蛇床子素常溫下不穩(wěn)定，需注意低溫貯藏，且操作時(shí)間不宜過長。此外，本研究還建立了同時(shí)測定蛇床子素和歐前胡素2個(gè)主要活性成分含量的方法。

本研究所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可控性高，能全面有效地控制蛇床子搽劑的質(zhì)量，為蛇床子搽劑的療效控制提供了可靠保障。

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（收稿日期：2017-11-16 修回日期：2018-02-26）

（編輯：林 靜）