謝文執(zhí)，羅洪斌,2,3,4，謝楓楓，楊晨宇

(湖北民族學(xué)院1. 醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室、2. 科技學(xué)院醫(yī)學(xué)系生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室、3. 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗室、4. 神經(jīng)精神共患病研究所，湖北 恩施 445000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是與年齡高度相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，可導(dǎo)致腦萎縮、神經(jīng)元與突觸的丟失和大腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)的減少，最終導(dǎo)致老年人認(rèn)知功能障礙和生活行為的困難。其主要病理改變?yōu)槟X海馬神經(jīng)元周圍的老年斑(amyloid-β protein,SP)、神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)、長期炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡等[1]。主要發(fā)病機(jī)制包括淀粉樣蛋白級聯(lián)反應(yīng)、Tau蛋白過度磷酸化、遺傳因素、神經(jīng)遞質(zhì)釋放異常、細(xì)胞凋亡等學(xué)說。NFTs是AD的特征性病理特征，主要由過度磷酸化的Tau蛋白構(gòu)成，在AD患者大腦皮層和海馬中NFTs的數(shù)量多少及其分布與癡呆嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[1-2]。而Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，主要分布于中樞神經(jīng)元軸突中，與微管的穩(wěn)定、物質(zhì)的運(yùn)輸以及神經(jīng)信息的傳遞密切相關(guān)[2]。

蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A,PP2A)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，廣泛參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、物質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡等反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)[2]，PP2A其催化亞基PP2Ac能明顯降低Tau蛋白的過度磷酸化，而AD患者腦內(nèi)PP2Ac表達(dá)量及活性卻較低。岡田酸 (okadaic acid,OA) 是一種海洋生物提取物，也是PP2A的特異性抑制劑，廣泛應(yīng)用于AD的實(shí)驗研究[3-4]。體內(nèi)和體外實(shí)驗均證明，OA能特異性抑制PP2A活性[4-5]，引起Tau蛋白多個位點(diǎn)的過度磷酸化，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[5]。

頭頂一顆珠 (TrilliumTschonoskiiMaxim,TTM) 為土家族道地藥材，多在我國土家族民間使用，常用于眩暈、跌打損傷、神經(jīng)衰弱的治療[6-7]。其主要成分為甾體皂苷，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)該藥具有抗腫瘤、消炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、改善心功能等功效[8]。有研究證明，TTM可通過增強(qiáng)大腦海馬和皮質(zhì)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性，減少丙二醛 (malonaldehyde,MDA)含量，通過抗氧化起到延緩衰老的作用[9]。TTM是否具有調(diào)節(jié)PP2A活性的作用目前尚不清楚，因此，有必要進(jìn)行深入研究，并掌握其詳細(xì)作用機(jī)制，促進(jìn)該藥開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑按人(60 kg)為標(biāo)準(zhǔn)，TTM每人每千克用藥的低、中、高劑量分別為0.083、0.167、0.333 g·kg-1，成人與大鼠的折算系數(shù)為6.25，大鼠(250 g)相當(dāng)于人的臨床等效低、中、高劑量分別為0.125、0.25、0.5 g·kg-1·d-1。TTM水煎液制備方法：稱量100 g TTM并切碎，煎取2次、混勻、過濾，再濃縮定量至0.4 kg·L-1備用。OA購自美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Tau-5抗體，美國Abcam公司；M-PP2Ac、DM-PP2Ac、PS307-PP2Ac，美國Cell Signaling Technology公司；pS396、pS404抗體，美國SAB公司；β-actin抗體，美國Proteintech公司。

1.2儀器DMS-2型Morris水迷宮測試系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；099C K5424組織勻漿機(jī)(美國Glas-Col公司)；電泳槽、濕轉(zhuǎn)槽、PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀電源(美國伯樂公司)；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)；VT1200S振蕩切片機(jī)(德國徠卡公司)；E200三目顯微鏡(日本尼康公司)。

1.3實(shí)驗動物與分組♂SD大鼠110只，體質(zhì)量(250±30)g，購自湖北省實(shí)驗動物研究中心，合格證號：42000600017418。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為10組：DMSO 1周組、OA 1周組、TTM灌胃1周低、中、高劑量組、DMSO 2周組、OA 2周組、TTM灌胃2周低、中、高劑量組，每組10只。另選10只SD大鼠備用。

1.4造模和水迷宮訓(xùn)練給藥1周組、給藥2周組分別給予TTM灌胃1周、2周；OA 1周、OA 2周組、DMSO 1周、DMSO 2周組分別用飲用水灌胃。用藥1周組在灌胃d 2同時進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練(水迷宮訓(xùn)練方法參照文獻(xiàn)[10])，在灌胃d 7行海馬注射OA，測試前24 h，OA組和治療組雙側(cè)海馬注射OA各1.5 μL(濃度均為0.392 mmol·L-1)，DMSO組同樣位置各注射10% DMSO 1.5 μL。用藥2周組在灌胃d 9開始水迷宮訓(xùn)練，訓(xùn)練和測試方法同用藥1周組。

1.5海馬勻漿蛋白Westernblot分析實(shí)驗方法參照本課題組前期實(shí)驗[10]。一抗(p-Tau-Ser 396、p-Tau-Ser 404、Tau 5、M-PP2Ac、DM-PP2Ac、PS307-PP2Ac等)；熒光二抗(IRDye 800CW 羊抗小鼠IgG、IRDye 800CW 羊抗兔IgG)。Odyssey系統(tǒng)掃描成像，Image J計算灰度值。

1.6腦片尼氏染色用顯微鏡挑選大小合適、無破損的海馬腦片，用PBS清洗后，置于載玻片上，滴加適量的尼氏染色液，室溫孵育20 min，脫水、透明后封片觀察。

2 結(jié)果

2.1TTM對AD模型大鼠空間認(rèn)知功能的影響Fig 1的水迷宮實(shí)驗結(jié)果顯示，注射OA后的大鼠逃避潛伏期明顯長于注射前，OA組大鼠逃避潛伏期明顯長于DMSO組，且游泳軌跡穿越第3象限平臺的目的性弱，總的游泳路程長，用時長，說明AD模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶有障礙。預(yù)先給予TTM低、中、高劑量組逃避潛伏期均明顯短于OA組，用藥2周者具有劑量依賴性，且游泳軌跡穿越第3象限平臺的目的性強(qiáng)，總的游泳路程短，用時少。上述結(jié)果提示，TTM低、中、高劑量均能有效改善OA大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙。

2.2TTM對AD模型大鼠腦海馬PP2A活性的影響Fig 2的Western blot結(jié)果顯示，與DMSO組比較，OA組甲基化水平明顯下降，去甲基化水平明顯上升，PP2Ac Y307磷酸化水平上升，表明PP2Ac活性降低。與OA組比較，TTM中、高劑量組甲基化水平升高，去甲基化水平和PP2Ac 在Y307位點(diǎn)上磷酸化水平明顯降低，表明PP2Ac活性升高。結(jié)果表明，中、高劑量的TTM能提高PP2A活性，特別是高劑量組效果更為明顯，并具劑量依賴性。

2.3TTM對AD模型大鼠腦海馬Tau蛋白磷酸化的影響如Fig 3所示，OA組Tau蛋白pS396、pT404位點(diǎn)的磷酸化水平明顯高于DMSO組，而TTM治療1周高劑量組和治療2周中、高劑量組的Tau蛋白pS396、pT404位點(diǎn)的磷酸化水平低于模型組，并呈劑量依賴性，說明高劑量TTM能有效降低Tau蛋白的磷酸化水平。

2.4尼氏染色法結(jié)果如Fig 4所示，在海馬CA1和CA3區(qū)，DMSO組尼氏小體數(shù)量明顯多于OA組。TTM治療組與OA組相比，治療1周中、高劑量組CA1和CA3區(qū)尼氏小體數(shù)量多于OA組。TTM治療2周高劑量組CA1區(qū)尼氏小體數(shù)量多于OA組，而在CA3區(qū)TTM低、中、高劑量組尼氏小體數(shù)量多于OA組，且高劑量組最為明顯。提示TTM高劑量組能明顯增加AD大鼠海馬區(qū)尼氏小體的數(shù)量，修復(fù)損傷神經(jīng)元。

Fig 1 1 week and 2 weeks of TTM administration prevented rats from OA-induced spatial memory retention

A: The 1 week and 2 weeks of TTM administration repaired the swimming pathway recorded 24 h after OA injection; B: The 1 week and 2 weeks of TTM administration prevented rats from OA-induced spatial memory retention dysfunction. 1:DMSO;2:OA;3:OA+TTM 0.125 g·kg-1·d-1;4:OA+TTM 0.25 g·kg-1·d-1;5:OA+TTM 0.5 g·kg-1·d-1.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsbefore OA injection;ΔP<0.05vsafter OA injection.

Fig 2 Effects of 1 week(A) and 2 weeks(B) of TTM administration on OA-induced inhibition of

1:DMSO;2:OA;3:OA+TTM 0.125 g·kg-1·d-1;4:OA+TTM 0.25 g·kg-1·d-1;5:OA+TTM 0.5 g·kg-1·d-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsOA injection

Fig 3 Effects of 1 week(A) and 2 weeks(B) of TTM administration on OA-inducedTau hyperphosphorylation in SD rat

1:DMSO;2:OA;3:OA+TTM 0.125 g·kg-1·d-1;4:OA+TTM 0.25 g·kg-1·d-1;5:OA+TTM 0.5 g·kg-1·d-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsOA injection.

Fig 4 Effects of 1 week (A) and 2 weeks (B) of TTM administration on OA-induced Nissl'sbodies' decrease in SD rat

1:DMSO;2:OA;3:OA+TTM 0.125 g·kg-1·d-1;4:OA+TTM 0.25 g·kg-1·d-1;5:OA+TTM 0.5 g·kg-1·d-1.**P<0.01 and*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsOA injection.

3 討論

AD是與神經(jīng)退行性病變相關(guān)的疾病，不僅導(dǎo)致認(rèn)知功能下降，而且會引起心理或行為的一系列變化，導(dǎo)致一系列社會經(jīng)濟(jì)問題[11]。文獻(xiàn)報道[1]，AD患者腦組織中PP2A的表達(dá)和活性均明顯下降，其與毒性淀粉樣蛋白Aβ1-40,42的增多呈負(fù)相關(guān)，而AD患者腦內(nèi)特征性病理改變SP的主要成分即為神經(jīng)元外的Aβ1-40,42，該淀粉樣蛋白可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和凋亡，最終導(dǎo)致腦萎縮和認(rèn)知功能障礙。PP2A的表達(dá)和活性下降還可導(dǎo)致Tau蛋白過度磷酸化，并形成AD的另一個特征性病理改變NFTs，也可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。大鼠腦海馬內(nèi)注射OA可有效抑制PP2A的活性，誘導(dǎo)記憶損傷，常伴有明顯的神經(jīng)病理變化，包括Tau蛋白的過度磷酸化和Aβ淀粉樣斑塊[12-13]，可有效構(gòu)建AD模型，并反映其認(rèn)知功能障礙。因此，本課題通過大鼠腦海馬區(qū)注射OA抑制PP2A活性，誘導(dǎo)構(gòu)建AD模型，然后給予TTM處理，以觀察該藥是否能通過調(diào)控PP2A活性，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)該模型大鼠的認(rèn)知功能障礙。已有文獻(xiàn)報道[7,9]，TTM作為土家族特色藥材在抗AD方面有一定療效和研究基礎(chǔ)，其作用機(jī)制可能是通過升高AD大鼠腦組織的SOD、GSH-Px活性，從而抗氧化，降低MDA蓄積，最終達(dá)到延緩衰老作用。但TTM能否上調(diào)PP2A表達(dá)及活性，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)Tau蛋白的過度磷酸化和Aβ 1-40,42的表達(dá)，目前尚未見文獻(xiàn)報道。為了觀察TTM不同劑量和不同的給藥時間對AD的影響，本實(shí)驗TTM分為低、中、高3個劑量[14]，在給藥時間長度上分為1周、2周，以摸清不同劑量和不同時間點(diǎn)其藥效如何。

水迷宮行為學(xué)實(shí)驗測試結(jié)果顯示，無論是用藥1周還是2周，用藥組大鼠穿過目的象限的次數(shù)增多，逃避潛伏期縮短，游泳軌跡穿越第3象限平臺的目的性強(qiáng)，總的游泳路程短，用時少，呈一定的搜索策略，且與劑量具有一定依賴性。用藥2周組整體水平略好于用藥1周組。這一結(jié)果表明TTM可有效改善AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，并具有劑量-時間依賴性。

Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TTM用藥1周和2周的中、高劑量組PP2A甲基化水平升高，而去甲基化水平和PP2Ac在Y307位點(diǎn)上的磷酸化水平明顯降低，PP2A甲基化水平與其活性呈正相關(guān)，PP2Ac去甲基化水平和Y307位點(diǎn)的磷酸化水平與其活性呈負(fù)相關(guān)。該結(jié)果說明，兩個時間點(diǎn)的TTM可有效提高OA抑制的AD大鼠腦海馬PP2A活性。同時結(jié)果顯示，兩個時間點(diǎn)TTM的中、高劑量組中，Tau蛋白pS396、pT404兩個位點(diǎn)的磷酸化水平低于OA組，特別是2周時間點(diǎn)更明顯，而低劑量與OA組差異不明顯，表明TTM能有效降低AD模型大鼠腦海馬Tau蛋白磷酸化水平，并呈劑量依賴性。

尼氏體可反映神經(jīng)細(xì)胞的功能活性[15]，當(dāng)神經(jīng)元受損時，尼氏小體將會溶解，直至完全消失，但該病變具有可逆性。因此，有必要檢測尼氏體以掌握TTM能否修復(fù)或改善受損神經(jīng)元的功能活性。本實(shí)驗用尼氏染色法檢測海馬區(qū)尼氏體的數(shù)量和分布情況，結(jié)果表明用藥1周組，在海馬CA1和CA3區(qū)，TTM中、高劑量組尼氏小體數(shù)量多于OA組，而在2周組中海馬CA1區(qū)，TTM高劑量組尼氏小體數(shù)量明顯多于OA組，在CA3區(qū)，低、中、高劑量組均明顯多于OA組。此結(jié)果提示，TTM中、高劑量組在不同時間點(diǎn)均能明顯增加AD大鼠海馬區(qū)尼氏小體的數(shù)量，修復(fù)受損神經(jīng)。

上述實(shí)驗結(jié)果表明，TTM能有效提高OA抑制的AD大鼠腦海馬PP2A活性，降低其誘導(dǎo)的Tau蛋白過度磷酸化水平，增加海馬區(qū)尼氏小體的數(shù)量，從而改善AD大鼠空間記憶能力，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，且與用藥時間具有一定相關(guān)性。而TTM是否與用藥時間呈更廣范圍的依賴性還有待于進(jìn)一步的研究和探討。