陳澤慧，章 亮，柴冰陽(yáng)，張 波

(新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002)

黑色素瘤是由異常黑色素細(xì)胞過(guò)度增生引發(fā)的皮膚腫瘤，容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，被認(rèn)為是侵襲性較強(qiáng)的腫瘤，也是皮膚癌的主要死亡原因之一，故黑色素瘤轉(zhuǎn)移的研究意義重大。體外實(shí)驗(yàn)僅能檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，但機(jī)體內(nèi)的影響無(wú)法模擬。為更好地研究腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的機(jī)制，穩(wěn)定的在體腫瘤轉(zhuǎn)移模型是整個(gè)研究的基礎(chǔ)。目前，在體轉(zhuǎn)移模型以尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞為主[1]，使腫瘤細(xì)胞直接通過(guò)血液進(jìn)入全身循環(huán)，此模型可更為準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)藥物的抗轉(zhuǎn)移藥效，成為篩選藥物的首選。

該種方式雖具有實(shí)驗(yàn)周期短、實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但技術(shù)操作難度大。由于鼠類尾靜脈較細(xì)，尾靜脈注射有一定難度[2]，故成功率難以保證，限制了模型的作用。也有文獻(xiàn)報(bào)道，使用兔建立脈絡(luò)膜黑色素瘤模型[3]，但涉及精密的眼科手術(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)者技術(shù)要求較高，術(shù)后處理較為繁瑣，因此，本文旨在建立一種操作簡(jiǎn)便、成功率較高的模型。有研究表明[4]，原位腫瘤在轉(zhuǎn)移前，能夠在特定器官組織部位誘導(dǎo)形成一個(gè)有利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的微環(huán)境，包括免疫抑制、炎性反應(yīng)、血管生成、通透性增強(qiáng)等特征，抑制機(jī)體的免疫將有助于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，免疫抑制劑的使用可以幫助轉(zhuǎn)移模型的成功建立。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)，♀♂各半，6～7周齡，體質(zhì)量(20～25) g，5只為1籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)水進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房溫度保持在(23±2)℃，濕度40%～ 60%，光照和黑暗時(shí)間各12 h。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的管理和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均遵守中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例和石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.1.2細(xì)胞 B16F10細(xì)胞(小鼠皮膚黑色素瘤細(xì)胞)，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3試劑與儀器 地塞米松磷酸鈉注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司)；DMEM低糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司) ；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素6(interleukin 6，IL-6)、白介素10(interleukin 10，IL-10)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)檢測(cè)試劑盒(上海西唐生物技術(shù)有限公司)。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；超凈工作臺(tái)(上海智誠(chéng)分析儀器有限公司)；正置熒光顯微鏡Axio Imager A2(德國(guó)Zeiss公司)。

1.2方法

1.2.1免疫抑制劑的篩選及相關(guān)基因分析 通過(guò)The Comparative Toxicogenomics Database (CTD)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ctdbase.org/)找到臨床常用的5種免疫抑制劑在動(dòng)物造模中的靶點(diǎn)，對(duì)這些靶點(diǎn)通過(guò)String(https://string-db.org/)分析靶點(diǎn)間相互作用，用BioGPS(http://biogps.org/#goto=welcome)分析各靶點(diǎn)在組織的分布情況，數(shù)值大于70者認(rèn)為在該組織分布較多。進(jìn)而在Cytoscape (Version: 3.2.1)中做出網(wǎng)絡(luò)圖，并利用Cytoscape插件Network Analyzer對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析[5]。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(青霉素100 kU·L-1、鏈霉素100 mg·L-1)，在37℃、5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d傳代1次。臺(tái)盼藍(lán)拒染法確定活細(xì)胞數(shù)，每次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞活力保持在95%以上。

1.2.3動(dòng)物模型的建立 20只C57BL/6小鼠分為4組：空白組、陰性對(duì)照組(僅腹腔注射地塞米松)、陽(yáng)性對(duì)照組(僅尾靜脈注射細(xì)胞)、造模組(腹腔注射地塞米松及尾靜脈注射細(xì)胞)。陰性對(duì)照組及造模組小鼠每天腹腔注射地塞米松50 mg·kg-1[6]。d 3取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F10細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，培養(yǎng)基重懸收集細(xì)胞，離心，用適量磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為1×109·L-1備用。用75%乙醇消毒小鼠尾部皮膚，取上述B16F10細(xì)胞懸液接種于陽(yáng)性對(duì)照組及造模組小鼠尾靜脈，每只接種0.2 mL，即每只小鼠接種2×105個(gè)B16F10細(xì)胞。接種后，陰性對(duì)照組及造模組小鼠繼續(xù)注射地塞米松7 d，每天觀察小鼠體質(zhì)量及生活習(xí)性的改變等情況。

1.2.4血清TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF、MMP-9含量的測(cè)定 所有步驟均按照ELISA試劑盒的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。在接種細(xì)胞后的第3周，稱取所有小鼠體質(zhì)量，摘眼球取血于EP管中，室溫靜置30 min后，3 500 r·min-1離心10 min，取血清。每個(gè)血清樣品設(shè)2個(gè)復(fù)樣，分別向TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF、MMP-9抗體預(yù)包被的96孔板內(nèi)加入待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃孵育40 min。洗滌，加第一抗體工作液。洗滌，加酶標(biāo)抗體工作液37℃孵育10 min。洗滌，加底物工作液37℃暗處孵育15 min后，加終止液結(jié)束反應(yīng)。30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的光密度(optical density, OD)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF、MMP-9含量。

1.2.5肺部及全身其他臟器的轉(zhuǎn)移情況 解剖小鼠，觀察肺、淋巴結(jié)、腦、肝、腎等臟器有無(wú)轉(zhuǎn)移灶，計(jì)算肺部轉(zhuǎn)移的結(jié)節(jié)數(shù)。

1.2.6肺部轉(zhuǎn)移病灶的病理學(xué)檢查 對(duì)肺部轉(zhuǎn)移灶行病理取材，置于4%甲醛固定24 h后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制成石蠟切片，蘇木精伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，鏡下觀察[7]。

2 結(jié)果

2.1免疫抑制劑的篩選及相關(guān)基因分析選擇臨床常用的5種免疫抑制劑：環(huán)孢素(cyclosporin A, CsA)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)、地塞米松(dexamethasone, DXMS)、雷帕霉素(rapamycin, RAPA)及抗淋巴細(xì)胞球蛋白(antilymphocyte globulin, ALG)作為候選。5種藥物在動(dòng)物造模中分別有39、21、32、16、1個(gè)靶點(diǎn)，其中有27個(gè)靶點(diǎn)是兩藥及兩藥以上共有靶點(diǎn)。將所有靶點(diǎn)進(jìn)行組織分布分析后發(fā)現(xiàn)，TIMP-1、STAT3、FOS、AKT1、APP、MAPK3、VIM在肺中占比較多，ABCB4、OVAL、ALB、F7、SOD1在肝臟中占比較多?；?5個(gè)節(jié)點(diǎn)(5個(gè)免疫抑制劑和50個(gè)相關(guān)靶點(diǎn))和111個(gè)邊，構(gòu)建了5種免疫抑制劑的靶點(diǎn)-組織網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 1)。圖中灰色八邊形節(jié)點(diǎn)為免疫抑制劑，圓形節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)，其中藍(lán)色圓形節(jié)點(diǎn)為肺中靶點(diǎn)，粉色圓形節(jié)點(diǎn)為肝臟中靶點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)的大小由其接近中心度決定，接近中心度越大，節(jié)點(diǎn)越大，節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的位置越重要。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)(Tab 1)，在實(shí)驗(yàn)中選擇地塞米松作為免疫抑制劑。

2.2小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF、MMP-9的含量如Tab 2所示，陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清中IL-6、IL-10、MMP-9的含量與空白組相比明顯升高(P<0.01)，而造模組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF、MMP-9的含量均明顯升高(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3接種后小鼠的一般情況尾靜脈注射過(guò)程中，10只小鼠均未見(jiàn)死亡，精神狀態(tài)好，反應(yīng)靈敏。4組小鼠在造模前體質(zhì)量無(wú)明顯差異，在飼養(yǎng)過(guò)程中，陰性對(duì)照組體質(zhì)量下降最多，其余3組無(wú)明顯變化(Fig 2)，生活習(xí)性無(wú)改變。

Tab 1 Target-tissue network analysis data of five immunosuppressants

Fig 1 Target-tissue network map of five immunosuppressants

Fig 2 Body weight changes after inoculation of cells in mice n=5)

2.4小鼠肺部及其他臟器轉(zhuǎn)移情況空白組及陰性對(duì)照組小鼠臟器均無(wú)異樣，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠僅2只肺部出現(xiàn)1個(gè)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)較小，顏色較淡。造模組有3只小鼠的肺部出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，最多13個(gè)，最少3個(gè)，結(jié)節(jié)大且顏色黑，并發(fā)現(xiàn)有肝轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(Fig 3、Tab 3)。其他臟器均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。

2.5肺轉(zhuǎn)移灶的病理檢查結(jié)果鏡下見(jiàn)C57BL/6小鼠肺轉(zhuǎn)移模型組織切片，腫瘤組織呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，部分肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡消失(Fig 4A)。B16F10肺轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，胞核深染，核質(zhì)比較大，異型性明顯(Fig 4B)。

Fig 3 Metastatic foci of lung and liver after dissection of mice in each group

A: Blank; B:Negative control; C:Positive control; D: Model.

Fig 4 HE staining results of lung metastatic foci (×200)

A: Destruction of lung tissue structure; B: Atypia of tumor cells.

3 討論

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致絕大多數(shù)腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因[8]。盡管轉(zhuǎn)移機(jī)制的探討一直是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)，但是目前人們對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移的認(rèn)識(shí)還不是十分清楚。因此，建立良好的轉(zhuǎn)移模型對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移的研究具有至關(guān)重要的意義。該模型應(yīng)該具有易于建立、可重復(fù)性、成瘤時(shí)間短、有較長(zhǎng)的生存周期等特點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的轉(zhuǎn)移模型多用裸鼠，但裸鼠具有費(fèi)用高、生存環(huán)境要求高、對(duì)藥物耐受性較弱等缺點(diǎn)。因此，本研究旨在建立一種簡(jiǎn)便的黑色素瘤轉(zhuǎn)移模型，選用的是具有正常免疫功能的C57BL/6小鼠，以建立更理想的黑色素瘤轉(zhuǎn)移模型。為提高轉(zhuǎn)移成功率，本實(shí)驗(yàn)于接種細(xì)胞前后連續(xù)注射地塞米松9 d，抑制小鼠的正常免疫功能，成瘤率及成瘤質(zhì)量都有明顯提升。

Tab 2 Contents of TNF-α, IL-6, IL-10, VEGF and MMP-9 in serum of each group of

**P<0.01vsblank

Tab 3 Comparison of number ofmetastatic foci in mice and success rate

**P<0.01vspositive control

目前，用來(lái)誘導(dǎo)小鼠免疫抑制模型的藥物有氫化可的松、環(huán)磷酰胺、地塞米松等，其中環(huán)磷酰胺是應(yīng)用最廣泛，也是研究最多的一種建模藥物。但環(huán)磷酰胺屬于烷化劑，可以與DNA形成交聯(lián)，抑制DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖[9]，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移及生長(zhǎng)過(guò)程。地塞米松為甾體類抗炎藥，能抑制巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞活性，促進(jìn)胸腺細(xì)胞的凋亡[10]，相較于環(huán)磷酰胺更適宜作為造模藥物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地塞米松明顯增高了造模組小鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF、MMP-9的含量。健康人血清TNF-α水平通常很低，然而，TNF-α在一定范圍內(nèi)的升高往往與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、惡病質(zhì)相關(guān)。有研究檢測(cè)前列腺癌患者和正常人血清中TNF-α水平，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者血清中TNF-α的水平明顯高于其他前列腺癌患者[11]。IL-6能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使腫瘤細(xì)胞的侵襲力和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，增加腫瘤的惡性程度。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此作了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，癌癥患者的外周血和細(xì)胞中的IL-6水平明顯升高，并與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后以及復(fù)發(fā)相關(guān)[12]。IL-10為具有很強(qiáng)的免疫抑制活性，在自身免疫疾病及腫瘤免疫治療等方面均有重要作用，尤其是其促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用[13]。原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)均需要有新的血管生成，VEGF作為一種內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原和促血管生成因子，在轉(zhuǎn)移瘤的形成中起著十分重要的作用[14]。MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，且可以活化VEGF，其在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成及免疫監(jiān)視中起重要作用[15]。這均與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，說(shuō)明地塞米松確實(shí)通過(guò)抑制小鼠的免疫功能，提升了轉(zhuǎn)移瘤模型的成功率。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析可知，地塞米松的作用靶點(diǎn)中有與細(xì)胞免疫相關(guān)的重要靶點(diǎn)，其中TNF、IFNG為T細(xì)胞受體通路靶點(diǎn)，MAPK1、MAPK3、FOS、AKT1為B細(xì)胞受體通路靶點(diǎn)。也有腫瘤相關(guān)蛋白，如MMP-9、F7、TPR53等，在腫瘤增殖、遷移侵襲過(guò)程中具有重要作用。這些靶點(diǎn)也多分布在肺和肝臟，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果中不僅有肺轉(zhuǎn)移灶的產(chǎn)生，也伴有肝轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。然而，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中陰性對(duì)照組小鼠的體質(zhì)量下降，有可能是因?yàn)榈厝姿勺鳛殚L(zhǎng)效糖皮質(zhì)激素類藥物，有一定的肝毒性，改變了肝細(xì)胞的微環(huán)境，也導(dǎo)致了肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

不論是從實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還是從理論機(jī)制的角度，都表明本實(shí)驗(yàn)小鼠的黑色素瘤轉(zhuǎn)移模型制備成功。本實(shí)驗(yàn)方法制備的模型成瘤率高、成瘤時(shí)間短、生存時(shí)間長(zhǎng)、制作方法簡(jiǎn)單，為之后的藥物研究提供了較好的動(dòng)物模型。