梁喜才，姚瓔珈，王玉瑩，李秀麗，王雅萌，藺 瑩，時(shí) 悅，楊靜嫻

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚不明確，以β淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)級聯(lián)反應(yīng)假說最為公認(rèn)。淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)的水解異常，導(dǎo)致了Aβ42的形成，Aβ42聚集激活A(yù)D患者和小鼠腦中非受體酪氨酸激酶(non-receptor tyrosine kinase,FYN)的活性，而FYN的表達(dá)增加，加重Aβ誘導(dǎo)的突觸損傷和過早死亡[1]。在海馬區(qū)域，F(xiàn)YN是突觸后致密物質(zhì)的組成成分之一，能夠通過磷酸化N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptors,NMDAR)，使NMDAR2B磷酸化增加，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，造成突觸損傷、神經(jīng)元凋亡，從而引起和加重AD的發(fā)生和發(fā)展[2-3]。

人參二醇(panaxadiol,PD)是從人參中提取出的有效成分。目前，國內(nèi)外研究表明，PD對受損的神經(jīng)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，而且對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力也有改善作用[4-6]。本實(shí)驗(yàn)利用APP轉(zhuǎn)染小鼠神經(jīng)母瘤細(xì)胞(mouse neuroblastoma N2a cells,Neuro-2a)，構(gòu)建AD的細(xì)胞模型作為體外實(shí)驗(yàn)，以探索PD對AD的治療作用，為將人參進(jìn)一步開發(fā)成為治療AD新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1細(xì)胞株N2a細(xì)胞、293T細(xì)胞，均購于首都醫(yī)科大學(xué)。

1.2藥物與試劑PD購于成都普菲德公司(純度98.36%，批號19666-76-3)。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶消化液、青霉素/鏈霉素(penicillin and streptomycin,P/S)，均購于Gibco公司；APP595/596質(zhì)粒、GFP質(zhì)粒DNA，以及慢病毒輔助質(zhì)粒pLP1、pLP2、pLP/VSV-G，均為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建；Lipofectamine TM 2000購于Invitrogen公司；MTT細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒購于Dojindo公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒購于南京建成生物技術(shù)有限公司；凋亡試劑盒購于天津三箭生物技術(shù)股份有限公司；鈣離子熒光探針購于AAT Bioquest；FYN-Y416抗體購于ABclone。

1.3儀器Ti-S型熒光顯微鏡(日本尼康)；CO2培養(yǎng)箱(美國UNAIRE公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；ZHJH-C1112B雙人超凈工作臺(美國Agilent公司)。

2 方法

2.1網(wǎng)絡(luò)分析

2.1.1處方來源 進(jìn)入CNKI(http://kns.cnki.net/kns/brief/default_result.aspx)檢索頁面，選擇高級檢索，主題詞為“老年癡呆”，匹配詞選“模糊”，排序時(shí)間選2000-2017年，其余設(shè)為默認(rèn)。檢索出與“老年癡呆”相關(guān)文獻(xiàn)共9871條。并篩選《中醫(yī)方劑大辭典》中，方劑主治或功效中含有與“記”、“忘”、“智”、“癡”、“呆”等關(guān)鍵字的所有方劑[7]，共篩選出107個(gè)方劑，將方劑中的藥材按出現(xiàn)頻次進(jìn)行排序。

2.1.2人參小分子數(shù)據(jù)庫的建立 通過TCMSP (http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫，將所有的人參小分子的數(shù)據(jù)及AD靶點(diǎn)進(jìn)行收集和下載，人參共有380個(gè)化學(xué)小分子成分，通過對這些藥物分子的藥理學(xué)和分子特性(ADME/T OB≥30%；DL≥0.11；BBB≥-0.3)預(yù)測和評價(jià)，獲得人參潛在藥效成分，最終共有18個(gè)活性成分被收集。并通過TCMSP 檢索出29個(gè)AD相關(guān)靶點(diǎn)，并通過Pubmed數(shù)據(jù)庫檢索出與Ca2+相關(guān)靶點(diǎn)。

2.2分子模擬對接根據(jù)Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)下載FYN結(jié)構(gòu)。將靶標(biāo)和中藥中化學(xué)成分的三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PyMOL中，對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行清除配體，刪除靶蛋白分子結(jié)構(gòu)中的水分子，在將人參成分及分開的受體與配體導(dǎo)入AutoDockTools-1.5.6，加上極性氫原子，賦予電荷。以原配體分子所在的位置作為結(jié)合位點(diǎn)，活性口袋部分進(jìn)行分子定位，再將定位后的值輸入Vina軟件，進(jìn)行分子對接評分。分子對接后，以原配體分子與靶蛋白受體的對接分?jǐn)?shù)為域值，選取人參成分中的中藥化學(xué)成分與相關(guān)靶蛋白對接分?jǐn)?shù)高于閾值的靶蛋白，即認(rèn)為該靶蛋白與人參中藥中的化學(xué)成分具有較好的相互作用。并使用Cyto Scape_v3.5.0構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)(C-T-D 網(wǎng)絡(luò))。

2.3建立AD細(xì)胞模型N2a細(xì)胞、293T細(xì)胞均培養(yǎng)于高糖DMEM完全培養(yǎng)基 (10% FBS、1% P/S)中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換液1次。將目的質(zhì)粒用Lipofectamine 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。用濃縮病毒上清感染N2a細(xì)胞，感染3 d后，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光。

2.4MTT法檢測細(xì)胞活力將細(xì)胞以5×103/孔的密度接種于96孔板中， 分為GFP-N2a、APP-N2a、APP-N2a+PD 3組。24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，棄培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO，室溫靜置10 min，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度(A)值。

2.5LDH釋放量的檢測細(xì)胞以5×103每孔接種96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后取上清液，根據(jù)試劑盒說明書操作，用紫外-可見光分光光度計(jì)于510 nm下測定吸光度值。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度細(xì)胞接種于6孔板，分兩組分別處理：第1組用不含EDTA的胰酶消化，PBS清洗2遍后，加入5 μL Annexin V-Light 650混勻后，加入5 μL PI混勻，室溫避光反應(yīng)15 min；另一組分為GFP-N2a、APP-N2a、APP-N2a+PD、APP-N2a+PP2、APP-N2a+PP2+PD 5組，分別加Cal-630AM 10 μmol·L-1，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，室溫0.5 h，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。

2.7Westernblot檢測FYN-Y416的蛋白表達(dá)水平在PD及FYN抑制劑PP2作用24 h后，根據(jù)全蛋白提取試劑盒說明書提取N2a蛋白，將蛋白(20 μg)等量上樣到10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，膜封閉1 h，一抗FYN-Y416(1 ∶2 000)孵育過夜，室溫下用HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)孵育1 h，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存，并用Image J定量測定信號強(qiáng)度。

3 結(jié)果

3.1用藥頻次分析對治療AD的107個(gè)方劑進(jìn)行頻次分析，可得到188種藥材，從高到低頻次排序，統(tǒng)計(jì)出頻次前20的藥材見Tab 1。

3.2人參活性成分的篩選根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫評分標(biāo)準(zhǔn)分析，在人參中有18種化合物具有良好的口服生物利用度(OB≥30%)、類藥性(DL≥0.18)和血腦屏障滲透性(BBB≥-0.30)。人參篩選的活性化合物的化學(xué)信息和網(wǎng)絡(luò)信息見Tab 2。

Tab 1 Top 20 frequency of Chinese medicinein formulas of AD treatment

3.3AD相關(guān)靶點(diǎn)的篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行AD檢索，檢索到AD相關(guān)靶點(diǎn)29個(gè)(Fig 1)，將下載的靶點(diǎn)輸入到Uniprot數(shù)據(jù)庫，并通過Pubmed數(shù)據(jù)庫確定FYN可磷酸化GluN2B受體，使Ca2+濃度增加。

3.4人參成分與FYN分子對接結(jié)果將人參成分與FYN進(jìn)行分子對接，為使假陽性率降低，本研究組將人參成分采用AutoDockTools-1.5.6和Vina兩種方法與FYN進(jìn)行對接。結(jié)果顯示，有7個(gè)成分與FYN具有較好的相互作用，其中PD與FYN作用最好(Tab 3)。

3.5成功建立APP-N2a細(xì)胞模型將APP595/596及GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝病毒液，感染N2a細(xì)胞，3 d后可觀察到綠色熒光(Fig 2)，表明模型建立成功。

Tab 2 Active compounds of ginseng

續(xù)表2

Mol IDMolecule nameOB/%BBBDLStructure of compoundsMOL005356Girinimbin61.221.220.31MOL005357Gomisin B31.990.180.83MOL005360malkangunin57.71-0.170.63MOL005376Panaxadiol33.090.230.79MOL005384suchilactone57.520.280.56MOL005399alexandrin_qt36.910.880.75MOL005401ginsenosideRg5_qt39.560.210.79MOL000787Fumarine59.26-0.130.83

Fig 1 AD-related targets-disease network diagram

Fig 2 Expression of APP in N2a cells(×20)

TG:Transgenic; NTG:No Ttransgenic.

Tab 3 Docking scores of Gginseng compounds and FYN protein

3.6PD能明顯提高APP-Na2細(xì)胞的活力Fig 3的MTT檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染APP595/596基因的模型組細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.01)，而不同濃度的PD可使細(xì)胞活力上升，其中經(jīng)75 mg·L-1PD處理的細(xì)胞活力最高。上述結(jié)果顯示，75 mg·L-1PD為保護(hù)APP-N2a細(xì)胞的最佳濃度。

3.7PD減少APP-N2a細(xì)胞的LDH釋放量Fig 4的LDH檢測結(jié)果顯示，模型組LDH的釋放量為對照組的1.5倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；PD給藥組與模型組相比，能明顯降低LDH的釋放量(P<0.01)。

3.8PD抑制APP-N2a細(xì)胞的凋亡Fig 5流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示，模型組凋亡細(xì)胞的百分比80.9%，與對照組的16.4%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PD給藥組的凋亡細(xì)胞百分比為71.6%，明顯低于模型組，說明人參二醇能有效抑制APP-N2a細(xì)胞的凋亡。

Fig 3 The cell viability was detected by MTT

**P<0.01vsGFP group;##P<0.01vsAPP group

3.9PD降低AD細(xì)胞內(nèi)FYN-Y416蛋白表達(dá)Fig 6的Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比,模型組FYN-Y416蛋白的表達(dá)量明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，PD給藥組和FYN抑制劑組FYN-Y416表達(dá)明顯降低(P<0.01)。

Fig 4 The release of lactate dehydrogenasewas determined by LDH )

**P<0.01vsGFP group;##P<0.01vsAPP group

3.10PD減輕APP-N2a細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載如Fig 7所示，與模型組細(xì)胞數(shù)相比，對照組的細(xì)胞數(shù)的百分比為50%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而給藥組和抑制劑組細(xì)胞數(shù)的百分比分別為62.5%、68.75%，明顯高于模型組(P<0.01)，說明PD能減輕APP-N2a細(xì)胞的Ca2+超載。

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從生物網(wǎng)絡(luò)的角度，研究疾病發(fā)生和發(fā)展過程，認(rèn)識藥物與機(jī)體的相互作用，并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)的新學(xué)科。應(yīng)用高通量組學(xué)數(shù)據(jù)、分子網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，對藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)整體的分析，有助于理解藥物的多靶點(diǎn)、多途徑網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模式，研究藥物的作用機(jī)制和促進(jìn)藥物創(chuàng)新。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)存在一定的局限性，若要將研究的結(jié)果用于臨床，尚需要藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

AD多起病于老年期，病程緩慢且不可逆，以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、記憶力衰退、語言以及社會適應(yīng)程度的改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)。國際阿爾茨海默病協(xié)會指出，每6 s就會確診1位AD患者，估計(jì)2015年全世界有4 680萬人患有癡呆癥，到2050年，這個(gè)數(shù)字將達(dá)到1.135億[9]。AD患者腦內(nèi)，Aβ與細(xì)胞性朊蛋白(PrPc)結(jié)合，激活了FYN，從而使NMDAR2B磷酸化增加[8]。FYN能夠磷酸化NMDAR2B的1472位點(diǎn)，該位點(diǎn)的磷酸化會阻礙NMDAR2B和接頭蛋白AP2的結(jié)合，進(jìn)而抑制其內(nèi)化，導(dǎo)致含有NMDAR2B的NMDA受體在細(xì)胞膜上表達(dá)增多，引起Ca2+大量內(nèi)流，導(dǎo)致Ca2+超載[10-13]，從而引起神經(jīng)元機(jī)能亢進(jìn)，介導(dǎo)記憶和認(rèn)知障礙。抑制AD神經(jīng)元過度活動(dòng)，恢復(fù)突觸前Ca2+儲存，可作為控制AD相關(guān)神經(jīng)元活動(dòng)過度的關(guān)鍵因素，并作為改善治療疾病的目標(biāo)[14]。

Fig 5 The anti-apoptosis cellstic effect of PD(75 mg·L-1) on the N2a cells transfected with APP595/596

A:Effects of PD on the APP-N2a apoptotic cells were measured by flow cytometry; B:Quantitative analysis of apoptosis in APP-N2a cells.**P<0.01vsGFP group;##P<0.01vsAPP group.

Fig 6 The expression of p-FYN protein was detected by Western

Fig 7 PD reduced intracellular Ca2+ overload in APP-N2a

A:The Ca2+levels of cells in all groups were measured by flow cytometry; B:Quantitative analysis of Ca2+levels in cells.**P<0.01vsGFP group;##P<0.01vsAPP group.

從CNKI中的9871檢索結(jié)果和《中醫(yī)方劑大辭典》中方劑主治或功效中含有與“記”、“忘”、“智”、“癡”、“呆”等關(guān)鍵字的所有方劑中，綜合整理出107個(gè)方劑，并對這107個(gè)方劑中的藥材進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到出現(xiàn)頻率最多的前20味中藥材，其中人參共出現(xiàn)68次，并根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫的評分準(zhǔn)則(OB≥30%；BBB≥-0.3；DL≥0.18)對人參成分進(jìn)行篩選，得出18個(gè)人參成分。再根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫及Pubemd數(shù)據(jù)庫預(yù)測出有關(guān)AD的相關(guān)靶點(diǎn)，從29個(gè)AD靶點(diǎn)中，篩選出FYN靶向參與了AD腦內(nèi)Ca2+的調(diào)控。并利用分子對接技術(shù)，對人參的18個(gè)成與FYN模擬對接，并篩選出評分最高的藥物為PD(9.5)。在體外成功構(gòu)建AD模型，進(jìn)一步研究了PD對APP-N2a細(xì)胞的保護(hù)作用，通過MTT法和LDH法發(fā)現(xiàn)，75 mg·L-1的PD對APP-N2a細(xì)胞具有促進(jìn)存活能力、減少損傷的保護(hù)作用。為了進(jìn)一步研究PD對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)室對FYN-Y416蛋白表達(dá)量及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，PD可以明顯降低APP-N2a細(xì)胞FYN-Y416蛋白表達(dá)，并減輕其Ca2+超載現(xiàn)象。

綜上所述，PD具有神經(jīng)保護(hù)作用，能通過抑制FYN的磷酸化，減輕AD細(xì)胞Ca2+超載現(xiàn)象，提高細(xì)胞的存活率，降低損傷程度，并且可減少細(xì)胞凋亡，為治療AD相關(guān)新藥研發(fā)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。