李 斌，閆志鵬，李慧星，李紹亮，李學(xué)思，郭書賢*

（1.南陽理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽 473004；2.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，河南 南陽 473004；3.河南省宋河酒業(yè)股份有限公司，河南 鹿邑 477265）

酒曲作為白酒釀造的原動力，直接影響到白酒的品質(zhì)。根據(jù)制曲溫度的不同，可分為高溫大曲（60～65℃）、中高溫大曲（55～60℃）、中溫大曲（50～55℃）和低溫大曲（40～50℃）[1]。大曲中的主要微生物是細(xì)菌、霉菌和酵母，根據(jù)微生物的種類和生活習(xí)性的不同，在酒曲的制作中，保持酒總體風(fēng)格的同時，要盡量兼顧各種微生物生長需要的適宜的溫度、濕度、pH、氧氣等，為微生物的生長繁殖創(chuàng)造一個良好的外界環(huán)境[2]。濃香型酒曲的細(xì)菌主要是乳酸細(xì)菌、芽孢桿菌和醋酸細(xì)菌，其中芽孢桿菌多數(shù)屬于耐熱的芽孢桿菌屬[3]。

傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)或變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）等技術(shù)只能對大曲中少數(shù)可以分離培養(yǎng)的菌種進(jìn)行研究，具有很大的局限性，而高通量測序技術(shù)具有高通量、高分辨率的優(yōu)勢，為準(zhǔn)確揭示微生物菌群的多樣性提供了強(qiáng)有力的手段，能夠充分展示微生物菌群的多樣性[4]。目前，Rocher 454、Illumina和Iontorrent是廣泛應(yīng)用的高通量測序平臺，Miseq是Illumina開發(fā)的第二代高通量測序技術(shù)，具有成本低、準(zhǔn)確率高、操作簡便的優(yōu)點，已被廣泛且成功地應(yīng)用于食品[5]、土壤[6-7]、水資源[8]等的微生物菌群分析。但目前應(yīng)用高通量測序技術(shù)對白酒釀造大曲的細(xì)菌的研究報道還比較少，只有陳玲等[9]以濃香型白酒大曲為研究對象，基于16S rRNA基因為目的片段，分別采用微生物指紋圖譜分析技術(shù)16S rDNA克隆文庫法和高通量測序法分析了大曲中細(xì)菌微生物群落的組成，得出大曲中的微生物主要分布于厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria/Chloroplast）4個菌門。劉延波等[10]采用高通量測序技術(shù)分析了濃香型白酒中溫曲和高溫曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)中溫曲中細(xì)菌主要分布于厚壁菌門，變形菌門，藍(lán)藻菌門；高溫曲中主要分布于厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、藍(lán)藻菌門、擬桿菌門（Bacteroidetes）和異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）。

因此，本研究采用高通量測序技術(shù)，利用Illumina公司Miseq測序平臺對濃香型白酒的中高溫曲和芝麻香型白酒的高溫曲進(jìn)行研究，分析了兩種大曲在白酒釀造過程中主要的細(xì)菌構(gòu)成，建立一套高通量測序技術(shù)分析白酒大曲細(xì)菌的方法，同時通過數(shù)據(jù)分析，完整的解析兩種大曲中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。為建立濃香型白酒大曲和芝麻香型白酒大曲的微生物信息數(shù)據(jù)庫，優(yōu)化大曲的發(fā)酵工藝和提升品質(zhì)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

濃香型白酒中高溫大曲1月齡（Z1）、2月齡（Z2）、4月齡（Z3），芝麻香型白酒高溫曲（AA1）：河南省宋河酒業(yè)股份有限公司。樣品采集后迅速粉碎密封，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

Taq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5 U/μL）：美國Thermo公司；E.Z.N.A.Soil DNA提取試劑盒：美國OMEGA公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒：美國Life公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Eppendorf公司；Pico-21臺式離心機(jī)：美國Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器：其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠；GelDoc-ItTS3凝膠成像系統(tǒng)：美國UVP公司；Miseq高通量測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

酒曲中微生物總DNA提取按照OMEGA試劑盒說明書中的方法和步驟進(jìn)行。

1.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及測序

PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)域。

PCR引物：Miseq測序平臺的通用引物[11]（341F：5'-CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNCCTACGGGNGGCWGCAG-3'，805R：5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×PCR buffer（5 μL），脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（0.1 mmol/L），Genomic DNA（10 ng），341F（0.5 μmol/L），805R（0.5 μmol/L），PlantiumTaq（0.05 U），用雙蒸水補(bǔ)充至50 μL。

PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s，共計5個循環(huán)；然后進(jìn)行94℃變性20s，45℃退火20s，65℃延伸30s，共計20個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對DNA回收。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA進(jìn)行精確定量，依托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

測序獲取原始序列，將雙末端序列融合為一個方向的序列并進(jìn)行質(zhì)量控制（quality control，QC）。

（1）序列融合，采用Flash1.2.3軟件融合雙末端序列，通過各樣品的barcode使數(shù)據(jù)回歸樣品，并對各樣品序列做質(zhì)量控制。

（2）QC分為4個步驟：采用V0.20.4 Prinseq軟件對序列閱讀框的3'端進(jìn)行質(zhì)控，截掉Q值（堿基質(zhì)量值）低于20的數(shù)據(jù)，提高后續(xù)序列融合比率；通過Flash軟件融合雙末端序列，使其形成一條序列；采用Prinseq軟件去除各樣品的引物序列、低于200 bp的序列、低復(fù)雜度序列和低質(zhì)量序列；去除非靶區(qū)域序列及嵌合體，首先采用1.30.1Mothur軟件的Pre.cluster模塊校正測序錯誤，校正過程當(dāng)中允許的最大錯配為1/150。其次，采用軟件Mothur內(nèi)的Uchime功能模塊，以Silva數(shù)據(jù)庫中的序列作為模板，去除嵌合體及非靶區(qū)域序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列的拼接

采用Illumina Miseq測序平臺得到樣本Z1、Z2、Z3、AA1對應(yīng)的原始序列分別為80 569條、48 223條、48 878條和52178條，其平均長度分別為466.53bp、466.37bp、464.75bp和468.62 bp。經(jīng)拼接、過濾，分別得到有效序列78 261條、46586條、47109條和50473條，其平均長度分別為426.63bp、427.06 bp、425.95 bp和429.46 bp。

2.2 序列豐富度和多樣性分析

基于高通量測序技術(shù)對濃香型白酒和芝麻香型白酒酒曲中細(xì)菌的測定序列數(shù)、操作分類單元（operationaltaxonomic units，OTU）和Alpha多樣性指數(shù)研究結(jié)果見表1。

Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)和Simpson指數(shù)是常用于描述微生物群落物種多樣性的Alpha多樣性指數(shù)，這4個多樣性指數(shù)可以對群落物種組成的豐富度及群落物種組成的均勻度進(jìn)行綜合性的評價，4個多樣性指數(shù)中的Shannon指數(shù)對微生物群落物種豐富度更為敏感。其中Shannon指數(shù)越大，群落物種的多樣性越高，而Chaol或ACE指數(shù)越大則表明群落物種豐富度越高，由Coverage指數(shù)可知本次實驗的取樣是否合理，若Coverage指數(shù)＞97%，則證明本次取樣是合理的。但Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低[12]。

表1 不同酒曲中細(xì)菌的序列數(shù)、OUT數(shù)及Alpha多樣性指數(shù)分析Table 1 Analysis of sequence number,operational taxonomic unit number and alpha diversity index of bacteria in differentJiuqu

由表1可知，盡管Z1、Z2、Z3、AA1樣品對應(yīng)的Alpha多樣性指數(shù)在絕對數(shù)值上略有差異，但都可以看出測序數(shù)據(jù)量已足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。對3個濃香型白酒和1個芝麻香型酒曲樣本中的細(xì)菌進(jìn)行測序，共獲得197 439條序列，聚類分析共產(chǎn)生2 574個OTU分類。通過對4個樣本的對比分析：Z3樣本的Shannon指數(shù)最大，為3.17，因而Z3樣本的細(xì)菌群落多樣性最高；而Z1樣本的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)最大，分別為1040.64、1174.37，表明Z1樣本的細(xì)菌群落物種的豐富度最大；4個樣本的Coverage指數(shù)均＞97%，說明試驗的取樣是合理的，測序結(jié)果能反映樣本的真實情況；而AA1樣本的Simpson指數(shù)最大，為0.51，則證明AA1樣本的群落多樣性最低。

2.3 香農(nóng)指數(shù)曲線分析

基于高通量測序技術(shù)對濃香型白酒和芝麻香型白酒酒曲中細(xì)菌的香農(nóng)指數(shù)進(jìn)行分析，香農(nóng)指數(shù)曲線如圖1所示。

香農(nóng)指數(shù)曲線反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)，它可以用來比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理。當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU[13-14]。

由圖1可知，隨著測序數(shù)量的增加，香農(nóng)指數(shù)曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理。隨著測定序列數(shù)目的增加，樣本Z1、Z2、Z3的Shannon指數(shù)值均高于2.5，說明Z1、Z2、Z3號樣品的物種多樣性和豐富度都較高；Z1樣本和Z2樣本的香農(nóng)指數(shù)曲線幾乎在同一曲線上，這是由于兩樣本的Shannon指數(shù)（分別為3.00和3.02）幾乎是相同的，所以微生物群落物種的多樣性幾乎是一樣的。而AA1號樣品的Shannon指數(shù)值較低，說明AA1號樣品的物種多樣性較低。

圖1 不同酒曲的香農(nóng)指數(shù)曲線Fig.1 Shannon index curves of differentJiuqu

2.4 屬水平各樣本中細(xì)菌的種類和相對豐度分析

基于高通量測序技術(shù)的濃香型白酒和芝麻香型白酒酒曲在屬的水平上分析細(xì)菌的種類和相對豐度，根據(jù)豐度將樣本中菌屬分為優(yōu)勢菌屬（豐度≥1.0%）和次要菌屬（豐度＜1.0%），且將次要菌屬歸類于其他（others），其結(jié)果見圖2～5。

圖2 Z1酒曲樣本中細(xì)菌屬及相對豐度Fig.2 Genus and relative abundance of bacteria inJiuquZ1

由圖2可知，Z1酒曲樣本中相對豐度≥1.0%的優(yōu)勢細(xì)菌屬有9個，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）占比最大，為31%；其次為葡萄球菌屬（Staphylococcus），所占比例為26%；其余依次為魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、泛菌屬（Pantoea）、片球菌屬（Pediococcus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、腸桿菌屬（Enterobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）。

由圖3可知，Z2酒曲樣本中相對豐度≥1.0%的優(yōu)勢細(xì)菌屬有9個，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）所占比例最大，為51%；其次為明串珠菌屬（Leuconostoc），所占比例為10%；其余依次為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspo-ra）、泛菌屬（Pantoea）、乳球菌屬（Lactococcus）和不動桿菌屬（Acinetobacter）。

圖3 Z2酒曲樣本中細(xì)菌屬及相對豐度Fig.3 Genus and relative abundance of bacteria inJiuquZ2

圖4 Z3酒曲樣本中細(xì)菌屬及相對豐度Fig.4 Genus and relative abundance of bacterial inJiuquZ3

由圖4可知，Z3酒曲樣本中相對豐度≥1.0%的優(yōu)勢細(xì)菌屬有8個，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）所占比例最大，為56%；其次為魏斯氏菌屬（Weissella），所占比例為12%；其余依次為片球菌屬（Pediococcus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和乳球菌屬（Lactococcus）。

圖5 AA1酒曲樣本中細(xì)菌屬及相對豐度Fig.5 Genus and relative abundance of bacterial inJiuquAA1

由圖5可知，AA1酒曲樣本中相對豐度≥1.0%的優(yōu)勢菌屬比較少，主要是芽孢桿菌屬（Bacillus）和別樣芽胞桿菌屬（Allobacillus），所占比例分別為91%和2%。別樣芽胞桿菌屬（Allobacillus）是一類革蘭氏陽性菌，需氧菌，球形孢子位于末端，具膨脹的孢子囊。氫氧化鉀試驗和L-丙氨酸氨基肽酶均為陰性。模式種是Allobacillushalotolerans[15]。這個屬是近年才確立的，2011年臺灣學(xué)者SHEU S Y等[15]在蝦醬里首次發(fā)現(xiàn)Allobacillus halotoleransgen.nov.，sp.nov.，本文首次在芝麻香型高溫酒曲里發(fā)現(xiàn)該屬。

對不同月齡的濃香型白酒酒曲中的細(xì)菌菌屬種類和相對豐度進(jìn)行比對分析，結(jié)果見表2。

表2 濃香型白酒不同月齡酒曲中細(xì)菌菌屬及相對豐度Table 2 Genus and relative abundance of bacterial in theJiuquwith different ages

由表2可知，隨著濃香型白酒酒曲貯存時間的延長，乳桿菌屬（Lactobacillus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、片球菌屬（Pediococcus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）的相對豐度逐漸增加，而葡萄球菌屬（Staphylococcus）、泛菌屬（Pantoea）、芽孢桿菌屬（Bacillus）隨貯存時間的延長菌屬相對豐度越低。除此之外，明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）的相對豐度是先上升再下降，說明這兩類菌屬在貯存4個月過程會出現(xiàn)峰值，然后開始下降；魏斯氏菌屬（Weissella）則是先下降再上升。

3 結(jié)論

本研究基于Illumina MiSeq高通量測序研究了宋河酒業(yè)濃香型白酒中高溫酒曲和芝麻香型白酒高溫酒曲中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。在屬的分類水平上分析，濃香型白酒中高溫酒曲的優(yōu)勢類群（豐度≥1%）有9個，主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pedio-coccus）等。芝麻香型白酒高溫酒曲的優(yōu)勢類群（豐度≥1%）主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）和別樣芽胞桿菌屬（Allobacillus），豐度分別為91%、2%，其中別樣芽胞桿菌屬（Allobacillus）是首次在酒曲中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌屬，且豐度較高，其特性和功能尚不清晰，有待更加深入地研究。采用高通量測序技術(shù)對酒曲中的菌落物種分類研究，操作簡單、通量高、信息豐富，和傳統(tǒng)方法比較具有一定的優(yōu)越性。該研究成果為進(jìn)一步研究優(yōu)化制曲工藝、提高酒曲質(zhì)量指明了方向，具有重要的理論和實踐意義。