張宏森，蘇增平，王風(fēng)芹，楊大嬌，謝 慧，毛國濤，宋安東

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點實驗室，河南 鄭州 450002）

作為經(jīng)濟發(fā)展的基礎(chǔ)，能源的供給水平直接決定了社會經(jīng)濟的發(fā)展速度，探索一種綠色可持續(xù)的清潔能源生產(chǎn)方式是人類社會發(fā)展的必經(jīng)之路[1]。國際能源機構(gòu)在一份報告中希望全球化石能源結(jié)構(gòu)由目前85%～90%的比重降至2050年的46%，油、煤、氣等為主的化石能源格局向核能、風(fēng)能、太陽能、生物質(zhì)能等清潔能源的多元格局轉(zhuǎn)變[2]。地球上生物質(zhì)能源十分豐富，農(nóng)作物秸稈、農(nóng)林廢棄物、畜禽糞便、城鎮(zhèn)垃圾等都屬于生物質(zhì)能的范疇。根據(jù)計算世界上每年新形成的生物質(zhì)資源大約有1 800億t，可折算為900億t標(biāo)準(zhǔn)煤，約為全球總能源消耗的10倍[3]。這些生物質(zhì)資源的主要成分為木質(zhì)纖維素，利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇的技術(shù)已受到世界各國的廣泛關(guān)注，但是木質(zhì)纖維素中的木質(zhì)素成分成為該技術(shù)的一個瓶頸，不僅降解困難且降解后會產(chǎn)生大量有毒物質(zhì)，對菌體生長以及產(chǎn)物的生產(chǎn)具有極大的抑制作用[4]，生物質(zhì)氣化技術(shù)的出現(xiàn)為解決上述問題提供了一條新思路。

生物質(zhì)氣化技術(shù)是指將生物質(zhì)置于反應(yīng)器中在高溫高壓的條件下裂解為氣體，其主要組分為CO、H2、CO2、CH4等，另外也含有一些其他烴類和含氮氧化物[5]。一些專性厭氧的細(xì)菌如乙酸型厭氧梭菌可以直接利用合成氣組分產(chǎn)生乙醇[6]。生物質(zhì)的氣化過程可以消除不同原料間的化學(xué)差異性，一些有毒物質(zhì)和難以降解的有機物也可以被利用，可以直接越過傳統(tǒng)生物轉(zhuǎn)化過程中木質(zhì)素難以充分利用的障礙，原材料中的各組分先轉(zhuǎn)化為合成氣，再利用合成氣轉(zhuǎn)化為所需產(chǎn)物，有效地避開了傳統(tǒng)發(fā)酵中復(fù)雜的酶解脫毒等步驟，因此合成氣厭氧發(fā)酵技術(shù)被認(rèn)為是一項極具潛力和競爭力的技術(shù)[7]。另外，據(jù)不完全統(tǒng)計，中國每年焦?fàn)t煤氣的排放量約為400億m3，如果加以利用可以生產(chǎn)約1 300萬t乙醇，不僅能夠產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益，也能有效地緩解環(huán)境問題。

目前發(fā)現(xiàn)的能夠利用合成氣發(fā)酵的菌株種類很少且產(chǎn)量普遍較低，主要是從各類動物糞便中篩選出的一類嚴(yán)格厭氧的梭菌，Clostridium ljungdahlii、Clostridium autoethanogenum和Clostridium carboxidivorans是目前研究較多的合成氣乙醇發(fā)酵菌株[8-9]，而國內(nèi)尚未具有自主知識產(chǎn)權(quán)的專利菌株。從20世紀(jì)80年代，陸續(xù)有科研工作者從動物糞便、下水道污泥、農(nóng)業(yè)瀉湖等物質(zhì)中篩選到能利用合成氣生產(chǎn)乙醇的微生物。國內(nèi)科研工作者郭鈴等[10]從糞便里篩選出一株能夠利用合成氣組分發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的菌株，經(jīng)鑒定為菌株C.ljungdahlii。同時也有學(xué)者[10-13]研究發(fā)現(xiàn)很多合成氣發(fā)酵菌株也能夠?qū)⑼庠此徂D(zhuǎn)化為對應(yīng)醇，這也給乙醇發(fā)酵提供了一條新思路。以4種動物糞便（長臂猿，駱駝，豪豬，戴冕鶴）為樣品，以合成氣為原料進(jìn)行富集培養(yǎng)，并對目的菌群培養(yǎng)條件進(jìn)行初步優(yōu)化，通過聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerasechainreaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建分析目的菌群所含微生物種類，期望獲得1～2株能夠利用生物質(zhì)合成氣發(fā)酵產(chǎn)乙醇的新菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

G-fm18、C-fm18、H-fm18、BP-fm18：分別為從長臂猿，駱駝，豪豬，戴冕鶴糞便中富集傳代18代得到的菌群，動物糞便均取自鄭州市動物園；Clostridium autoethanogenum DSM10061：購自德國微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

合成氣（85.5%CO，10%H2，4.5%CO2）：購自河南源正科技發(fā)展有限公司。

WaterDNAKit（50）試劑盒、HandⅢDigestDNAMarker、DL2000 DNA Marker等：美國OMEGA公司。

10.0 mol/L NaOH溶液、1.0 mol/L HCl溶液、氧指示劑（0.2%的刃天青溶液）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

微量元素溶液1[14]：N（CH2COOH）31.5×103mg/L，ZnSO4·7H2O115mg/L，MnCl2·H2O30mg/L，H3BO348.5mg/L，CoCl·6H2O 200 mg/L，NiCl2·6H2O 60 mg/L，Na2MoO4·2H2O 37.5 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.5×103mg/L，Na2SeO310 mg/L，CuSO41.5 mg/L。

微量元素溶液2[15]：N（CH2COOH）32.0×103mg/L，MgSO41.00×103mg/L，（NH4）2Fe（SO4）2·6H2O0.80×103mg/L，CoCl2·6H2O 0.20×103mg/L，ZnSO4·7H2O 0.20×103mg/L，CuCl2·2H2O 20 mg/L，NiCl2·6H2O 20 mg/L，Na2MoO4·2H2O 20 mg/L，Na2O4Se 20 mg/L，Na2WO4·2H2O 20 mg/L。配制過程中N（CH2COOH）3最后加入，立即用10.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5。

維生素溶液1[14]：生物素20 mg/L，葉酸20 mg/L，鹽酸吡哆辛16 mg/L，硫辛酸60 mg/L，核黃素53 mg/L，鹽酸硫胺素56 mg/L，泛酸鈣56 mg/L，維生素B12（vitamin B12，VB12）50 mg/L，P-氨基苯甲酸53 mg/L，煙堿酸56 mg/L。

維生素溶液2[15]：VB610 mg/L，硫胺素5.00 mg/L，VB25.00mg/L，泛酸鈣5.00mg/L，硫辛酸5.00mg/L，對氨基苯甲酸5.00mg/L，煙堿酸5.00mg/L，VB125.00mg/L，生物素2.00mg/L，葉酸2.00mg/L。配好后用0.22μm過濾器過濾除菌使用。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基[15]：NaCl 1.20 g/L，NH4Cl 1.50 g/L，KCl 0.15 g/L，MgSO4·6H2O 0.30 g/L，CaCl20.06 g/L，KH2PO40.30g/L，酵母膏0.50g/L，2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethane sulfonic acid，MES）5.00 g/L，L-鹽酸半胱氨酸0.20 g/L，木糖5.00 g/L。微量元素溶液2添加10 mL，維生素溶液2添加10 mL，pH 5.75。pH的調(diào)節(jié)應(yīng)在加入MES后立即進(jìn)行。

篩菌富集培養(yǎng)基[16]：KH2PO40.57 g/L，NH4Cl 0.4 g/L，（NH4）2SO40.37 g/L，NaCl 0.41 g/L，MgCl2·6H2O 0.33 g/L，MgSO4·7H2O 0.04 g/L，CaCl2·2H2O 0.05 g/L，L-cys 0.5 g/L。微量元素溶液1添加2mL，維生素溶液1添加15 mL，pH6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基[17]：NaCl1.0g/L，NH4Cl1.0g/L，CaCl20.04g/L，MgSO4·6H2O 0.15 g/L，KH2PO40.10 g/L，胰蛋白胨2.00g/L，酵母膏0.3 g/L，L-鹽酸半胱氨酸0.2 g/L，MES 10.0 g/L，微量元素溶液2添加10 mL，維生素溶液2添加10 mL，pH 4.50。pH的調(diào)節(jié)應(yīng)在加入MES后立即進(jìn)行。

1.2 儀器與設(shè)備

YX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Agilent 7890A高效氣相色譜（gas chromatography，GC）儀（配火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），HP-FFAP柱）：美國Agilent公司；752N紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；H1850R臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；P680高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國戴安公司；SimpliAmpTMPCR儀：美國Thermo公司；DGGE電泳系統(tǒng)：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物的富集培養(yǎng)

培養(yǎng)基配制好以后，用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，每60 mL分裝入150 mL的厭氧培養(yǎng)瓶中，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱。在厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)加入0.05%刃天青溶液。配好的培養(yǎng)基放置在充滿合成氣的厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)24～36 h，刃天青紅色消退，滅菌前向厭氧瓶內(nèi)充3 s氮氣，保證培養(yǎng)基中氧氣全部清除，121℃滅菌30 min。將4種糞便加入滅菌后的富集培養(yǎng)基中，充入合成氣。37℃、150r/min條件下進(jìn)行富集培養(yǎng)。每隔15 d重新充入一次合成氣，45 d后一次富集培養(yǎng)結(jié)束。將培養(yǎng)液以10%的接種量加入新鮮培養(yǎng)液中進(jìn)行二次富集培養(yǎng)，重復(fù)以上操作。

1.3.2 殘留木糖對合成氣發(fā)酵菌群代謝的影響

為考察種子液中攜帶的少量木糖對于合成氣乙醇發(fā)酵的影響，選取富集至18代的種子液，離心去除種子液中所攜帶的乙醇和木糖，以無菌水重置為相同濃度的種子懸浮液，以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中；對照組為未離心的種子液，接種量也為10%。

1.3.3 微生物區(qū)系分析

參照文獻(xiàn)[18-19]的方法進(jìn)行實驗。

1.3.4 測定方法

產(chǎn)物測定：用注射器抽取2mL發(fā)酵液，于4℃、8000r/min離心10 min，取上清液用氣相色譜測定乙醇含量。

生物量測定：取富集液5 mL，用分光光度計測定波長600 nm處的吸光度值，以蒸餾水為空白對照測定發(fā)酵液中的生物量。

木糖含量測定：用注射器抽取2 mL發(fā)酵液，于4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液用高效液相色譜測定發(fā)酵前及發(fā)酵后的木糖含量。木糖對乙醇貢獻(xiàn)率及乙醇凈產(chǎn)量計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 富集培養(yǎng)菌群乙醇發(fā)酵性能研究

每隔30 d，對富集樣品取樣進(jìn)行乙醇含量和生物量的測定，其中第11～18代富集樣品培養(yǎng)30 d時乙醇含量和生物量如圖1所示。

圖1 4種菌群富集過程中乙醇產(chǎn)量（A）及生物量（B）變化Fig.1 Changes of ethanol production(A)and biomass(B)during enrichment process of four kinds of microflora

由圖1可知，乙醇產(chǎn)量隨傳代次數(shù)增加呈顯著上升趨勢，表明在厭氧條件下經(jīng)過富集馴化培養(yǎng)后，體系內(nèi)微生物群落能夠利用生物質(zhì)合成氣生產(chǎn)乙醇，且菌群G-fm18、BP-fm18的乙醇產(chǎn)量明顯高于菌群C-fm18、H-fm18；從第13代開始，生物量隨著傳代次數(shù)的增加呈遞減趨勢，表明經(jīng)過馴化培養(yǎng)后能夠在厭氧條件下利用生物質(zhì)合成氣的微生物數(shù)量在不斷減少，主要原因可能是一些不能利用合成氣或利用能力較差的微生物逐漸失去競爭優(yōu)勢，說明該實驗方法能夠有效地篩選出可以利用合成氣發(fā)酵的微生物。

2.2 種子液中殘留木糖對合成氣乙醇發(fā)酵的影響

圖2 不同菌群種子液離心前（A）、離心后（B）后發(fā)酵對乙醇產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect fermentation seed solution before(A)and after(B)centrifugation with different microflora on ethanol production

由圖2可知，種子液離心后發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量與不離心發(fā)酵相比極低。種子液離心后發(fā)酵時，對照菌株C.autoethanogenum的乙醇產(chǎn)量僅有29.07 mg/L，菌群G-fm18、C-fm18、H-fm18和BP-fm18的乙醇最高產(chǎn)量分別為35.86 mg/L、30.64 mg/L、27.59 mg/L和28.05 mg/L，其中菌群G-fm18的乙醇產(chǎn)量顯著高于對照菌株；種子液不離心發(fā)酵時，菌群G-fm18、C-fm18、H-fm18、BP-fm18的乙醇產(chǎn)量分別為304.16mg/L、246.43mg/L、220.58 mg/L和281.65 mg/L，對照菌株C.autoethanogenum的乙醇產(chǎn)量為233.86 mg/L，與厭氧瓶發(fā)酵的報道產(chǎn)量261.48 mg/L基本一致[9]，其中菌群G-fm18、BP-fm18的乙醇產(chǎn)量顯著高于對照菌株，菌群C-fm18的產(chǎn)量與對照菌株基本持平，說明篩選得到的優(yōu)勢菌群可以很好地利用生物質(zhì)合成氣生產(chǎn)乙醇，并且部分菌群的產(chǎn)乙醇能力甚至優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)菌株C.autoethanogenum。

表1 不同菌群種子液離心前對發(fā)酵的影響Table 1 Effect of seed solution before centrifugation with different microflora on fermentation mg/L

由表1可知，在除去總乙醇產(chǎn)量中木糖的貢獻(xiàn)率之后發(fā)現(xiàn)，各菌群的乙醇凈產(chǎn)量約為種子液離心后發(fā)酵的8倍，表明在合成氣發(fā)過程中添加少量的木糖能夠顯著促進(jìn)菌體對合成氣的利用效率，進(jìn)而提高乙醇產(chǎn)量。這是由于接種初期體系內(nèi)菌體濃度較低，而體系中氣液傳質(zhì)效率也很低，使得菌體的生長受到抑制作用進(jìn)而導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量較低，而種子液中少量殘留的木糖被帶入了發(fā)酵培養(yǎng)基，可以使微生物在接種前期能夠快速大量繁殖，提高合成氣的利用效率進(jìn)而提高乙醇產(chǎn)量。

2.3 微生物區(qū)系分析

2.3.1 DGGE圖譜分析

富集菌群DGGE圖譜如圖3所示，每個條帶大致與一個優(yōu)勢菌群對應(yīng)，條帶越多微生物種類越多，條帶強度大代表所對應(yīng)的微生物的相對數(shù)量越多。1#、2#、3#、4#分別對應(yīng)的樣品為G-fm18、C-fm18、H-fm18、BP-fm18，可以看出菌群C-fm18的微生物種類最多，優(yōu)勢微生物種類為4種，菌群BP-fm18的優(yōu)勢微生物為3種，菌群G-fm18的優(yōu)勢微生物為2種，菌群H-fm18樣品的種類比較單一，選擇如圖所示的7條優(yōu)勢條帶進(jìn)行下一步實驗。

圖3 富集菌群的DGGE圖譜Fig.3 DGGE of enriched microflora

2.3.2 測序結(jié)果分析

將DGGE圖譜上7條優(yōu)勢條帶割膠回收、純化、測序，測得16S rDNA序列結(jié)果在GeneBank數(shù)據(jù)庫中BLAST進(jìn)行檢索和同源性比對，7個條帶全部測出序列，結(jié)果見表2。將測序結(jié)果在NCBI中Blast后得到相似性最高的序列下載，同時加入已報道的利用合成氣產(chǎn)乙醇的主要菌種Clostridium carboxidivoransP7、Clostridium ljungdahlii、Clostridium autoethanogenum、Uncultured bacterium clone P11和Clostridiumsp.P11的16S rDNA序列，經(jīng)ClustalX序列比對后利用MEGA軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖4）。

表2 DGGE圖譜中不同細(xì)菌16S rDNA序列的比對結(jié)果Table 2 Comparison of 16S rDNA sequences of different bacteria in DGGE

圖4 優(yōu)勢細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the dominant bacteria

由表2與圖4可知，條帶1和條帶2為菌群G-fm18中的優(yōu)勢微生物條帶，但是測序結(jié)果差別很大，條帶1為水樣中不可培養(yǎng)菌，條帶2檢測結(jié)果與Paenibabacillussp.相似度達(dá)98%，屬于芽孢桿菌屬；條帶3和條帶4為菌群C-fm18中的優(yōu)勢微生物條帶，條帶3檢測結(jié)果與Citrobactersp.相似度達(dá)97%，該菌從污泥中分離，屬檸檬酸桿菌屬；條帶4檢測結(jié)果與Ruminococcusflavefaciens相似度達(dá)96%，屬于瘤胃球菌屬；條帶5為菌群H-fm18中的優(yōu)勢微生物條帶，檢測結(jié)果與Enterobacter cloacae相似度達(dá)97%，為腸桿菌屬；條帶6和條帶7為菌群BP-fm18中的優(yōu)勢微生物條帶，檢測結(jié)果分別與Clostridiumsp.cd6、Aeromonasenteropelogenes的相似度為96%和97%；Clostridium屬梭菌屬，該菌屬的微生物多數(shù)從動物腸道內(nèi)分離，厭氧，產(chǎn)芽孢。與已經(jīng)報道的利用合成氣產(chǎn)乙醇的主要菌種Clostridium carboxidivoransP7、Clostridium ljungdahlii、Clostridiumsp.P11和Clostridium autoethanogenum親緣關(guān)系相對最近的是條帶2，其次是條帶1和條帶5。其余條帶是動物腸道中的優(yōu)勢菌群，關(guān)于該菌屬的細(xì)菌是否能夠利用合成氣生產(chǎn)乙醇尚未見相關(guān)報道。

2.4 討論

富集培養(yǎng)基中合成氣是唯一的碳源，隨著傳代次數(shù)不斷增加，最終培養(yǎng)液中會僅存一種到數(shù)種能夠利用合成氣生長的優(yōu)勢微生物，對這些微生物進(jìn)一步的分離即可獲得能夠生產(chǎn)各類所需物質(zhì)的目的菌株。目前來說，合成氣發(fā)酵技術(shù)最大瓶頸是質(zhì)量傳遞限制[20]，其中主要的限制因素是氣液傳質(zhì)，一方面合成氣在培養(yǎng)液中溶解度較低，另一方面溶解在溶液中合成氣難以被微生物利用，這也是目前合成氣發(fā)酵過程中的溶劑產(chǎn)量較低的主要原因。培養(yǎng)基中存在的少量木糖可以使合成氣發(fā)酵菌種在前期迅速繁殖，以提高合成氣的利用效率，進(jìn)而提高乙醇產(chǎn)量。目前能利用合成氣發(fā)酵的菌株主要是梭菌屬以及芽孢桿菌屬的一類細(xì)菌，本實驗中篩選出的一些動物腸道優(yōu)勢細(xì)菌并沒有相關(guān)報道表明可以利用合成氣進(jìn)行發(fā)酵，在此基礎(chǔ)上應(yīng)對這些菌群進(jìn)行進(jìn)一步的富集培養(yǎng)或者分離獲得單一菌株，有望獲得能夠利用合成氣乙醇發(fā)酵的新菌株，這對于彌補國內(nèi)尚沒有自主知識產(chǎn)權(quán)的合成氣乙醇發(fā)酵菌株具有重大的意義。

3 結(jié)論

通過對篩選得到的4種菌群進(jìn)行傳代富集培養(yǎng)以及合成氣乙醇發(fā)酵實驗，發(fā)現(xiàn)4種菌群均能夠利用合成氣發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，且隨著傳代次數(shù)的增多，乙醇生產(chǎn)性能逐漸加強。種子液中攜帶的少量木糖可以顯著促進(jìn)合成氣發(fā)酵菌群（菌株）的乙醇產(chǎn)量，種子液不離心后接種發(fā)酵的情況下，菌群G-fm18的乙醇產(chǎn)量最高為253.87 mg/L，約為離心發(fā)酵后乙醇產(chǎn)量的8倍。4種菌群的優(yōu)勢微生物種類不多，但是測序結(jié)果表明每條優(yōu)勢條帶都對應(yīng)不同的微生物。G-fm18中主要含有一種不可培養(yǎng)細(xì)菌和芽孢桿菌；C-fm18中主要含有一種不可培養(yǎng)細(xì)菌、檸檬酸桿菌、瘤胃球菌和芽孢桿菌；H-fm18中主要含有腸桿菌；BP-fm18中主要含有一種不可培養(yǎng)細(xì)菌、梭菌和氣單孢菌。