吉玉玉，黃 慧，肖 洋，陳 雪，代園鳳，李 祝*，楊 龍，張 素，趙妗頤，唐婧紅，張欽語

（1.貴州省煙草公司 畢節(jié)市公司，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測院，貴州 貴陽 550016）

果蔬采后病原真菌的侵染是引起果實腐爛的重要原因之一[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，由微生物侵染造成的采后果蔬腐爛占20%～25%[3]。鏈格孢菌（Alternaria alternata）屬于半知菌亞門鏈格孢屬，是番茄、甜瓜、梨、蘋果等眾多果蔬采后病害的主要病原菌[4-5]，會造成貯藏、運(yùn)輸和銷售中的大量爛果，損失嚴(yán)重。目前，使用化學(xué)殺菌劑仍是現(xiàn)在世界各國控制采后果實病害的主要方法[6]。但是長期使用化學(xué)藥劑會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，還會因果蔬農(nóng)藥殘留量增加而威脅著人類的身體健康[7]。因此，發(fā)展無公害型生物農(nóng)藥來控制果蔬采后病害成為一種新趨勢，逐漸成為研究熱點(diǎn)[8-10]。在過去的20多年里，生物防治作為一種防治采后果實腐爛的有效方法而涌現(xiàn)出來[11-17]，此方法具有貯運(yùn)條件易控制、處理目標(biāo)明確、外界微生物干擾少、產(chǎn)品集中、處理費(fèi)用低廉等特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)[18]。目前，應(yīng)用較多的生防細(xì)菌主要有芽孢桿菌（Bacillusspp.）、土壤放射桿菌（Agrobacterium radiobacter）、假單胞桿菌（Pseudomonasspp.）等[19]。

芽孢桿菌屬菌是生物防治中常用的拮抗菌[20]，具有繁殖快速、生命力強(qiáng)、安全無毒等特點(diǎn)。ABDALLA S A等[21]測試了45株芽孢桿菌菌株抑制番茄早疫病菌的能力，發(fā)現(xiàn)其中28株有抑制鏈格孢菌生長的能力（表現(xiàn)出明顯的抑菌圈）。ARREBOLA E等[22]從水果表面分離出解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）PPCB004，發(fā)現(xiàn)其對7種不同柑橘采后的真菌病原體具有抗菌活性。巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）L2作為一種植物根系促生細(xì)菌[23]，是一種抑菌譜較廣的生防菌株[24]，針對不同植物的真菌和細(xì)菌病害均具有防治作用（如毛竹枯梢病[25]、煙草灰霉病[26]、香蕉灰斑病[26]、甘薯黑斑病[26]等），其中對真菌病原菌的抑制能力強(qiáng)于對細(xì)菌病原菌的抑制[27]。根據(jù)課題組前期初步研究，發(fā)現(xiàn)菌株L2可有效抑制鏈格孢菌的生長[28]。繼而以抑菌圈直徑評價菌株L2抗菌物質(zhì)對鏈格孢菌的抑制活性，采用響應(yīng)面法快速優(yōu)化產(chǎn)抗菌物質(zhì)的發(fā)酵條件，從而獲得最佳的發(fā)酵工藝來提高菌株L2的抑菌活性，有效預(yù)防由微生物侵染造成的采后果蔬腐爛現(xiàn)象，為研究開發(fā)新型果蔬生物防腐劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）L2：由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（China center for type culture collection，CCTCC）（武漢大學(xué)），保藏號：CCTCC NO.M2012381。

鏈格孢菌（Alternaria alternata）：由貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究室分離、篩選、鑒定并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L、蒸餾水1 L、pH自然。

NB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖5 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏3 g/L，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2（NA培養(yǎng)基：NB培養(yǎng)基中加入瓊脂15～20 g/L）。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；FA2204N電子天平：上海菁海儀器有限公司；SHP-250智能生化培養(yǎng)箱：上海光都儀器設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SHZ-83A離心機(jī)：榮華股份有限公司；PHS-3C精密酸度計：上海大普儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化與培養(yǎng)

將保存的巨大芽孢桿菌L2接種于NA斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)活化，再用接種環(huán)刮取兩環(huán)接種至NB培養(yǎng)液中，30℃、150 r/min培養(yǎng)20 h作為種子菌液。

1.3.2 發(fā)酵濾液的制備

在250mL三角瓶中裝入NB培養(yǎng)液后滅菌，無菌條件下向三角瓶內(nèi)接入種子菌液，30℃、150 r/min培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液經(jīng)5 500 r/min離心25 min，取上清液，經(jīng)孔徑0.22 μm的細(xì)菌過濾器過濾，除去菌體，制得無菌發(fā)酵濾液備用。

1.3.3 抑菌活性的測定

以鏈格孢菌為指示菌，采用牛津杯法[29]對發(fā)酵液抑菌活性進(jìn)行測定，活性大小以抑菌圈直徑（mm）表示。以未接種孢子懸液培養(yǎng)的PDA培養(yǎng)基作為空白對照，將牛津杯置于指示平板中央，取250 μL制備好的菌株L2無菌濾液于牛津杯中，28℃培養(yǎng)48h，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值。以上步驟均按無菌要求進(jìn)行操作，每個處理設(shè)3個重復(fù)。

1.3.4 巨大芽孢桿菌L2發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）單因素試驗

碳源：以葡萄糖、乳糖、麥芽糖、淀粉、蔗糖和山梨糖作為碳源，添加量為5 g/L，其他成分同初始培養(yǎng)基，配制發(fā)酵培養(yǎng)基。確定最佳碳源后對其進(jìn)行質(zhì)量濃度優(yōu)化，選取質(zhì)量濃度梯度為5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L。

氮源：以硝酸銨、尿素、硫酸銨、酵母膏、精氨酸、谷氨酸、牛肉膏作為氮源，添加量為5 g/L，其他成分同初始培養(yǎng)基，配制發(fā)酵培養(yǎng)基。確定最佳氮源后對其進(jìn)行質(zhì)量濃度優(yōu)化，選取質(zhì)量濃度梯度為2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L、4.0g/L、4.5g/L、5.0 g/L、5.5 g/L、6.0 g/L。

無機(jī)鹽：以不加無機(jī)鹽的培養(yǎng)基為空白，在此基礎(chǔ)上分別加入5g/L硫酸錳、硫酸鎂、氯化鈉、三氯化鐵、磷酸氫二鉀和碳酸鈣，其他成分同初始培養(yǎng)基，配制培養(yǎng)基。確定最佳無機(jī)鹽后對其進(jìn)行質(zhì)量濃度優(yōu)化，選取質(zhì)量濃度梯度為2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L、4.5g/L、5.0g/L、5.5g/L、6.0 g/L。

設(shè)置菌株L2在三角瓶的接種量依次為2%、4%、6%、8%、10%、12%；pH值梯度為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；裝液量依次設(shè)為25 mL/250 mL、50 mL/250 mL、75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL；將各種影響因素在NB發(fā)酵培養(yǎng)基的條件上逐一改變，確定每個因素的最佳范圍。

（2）響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

在單因素、PB試驗和最陡爬坡試驗的基礎(chǔ)上，以抑菌圈直徑作為響應(yīng)目標(biāo)，利用響應(yīng)面方法中的Box-Behnken Design（BBD）方法設(shè)計試驗，通過試驗數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型，最終確定最優(yōu)試驗條件。用Minitab軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素優(yōu)化

2.1.1 碳源種類及添加量的優(yōu)化

圖1 碳源對抑菌圈直徑的影響Fig.1 Effect of carbon sources on inhibitory zone diameter

不同碳源對菌株L2的抑菌效果見圖1。由圖1可知，巨大芽孢桿菌L2對葡萄糖、蔗糖、麥芽糖都能很好的利用。葡萄糖作為唯一碳源時，抑菌圈直徑達(dá)到（14.55±0.43）mm，比其他糖的效果都好，故選擇葡萄糖作為菌株L2液體培養(yǎng)基的碳源。不同質(zhì)量濃度葡萄糖的抑菌效果見圖2。

圖2 葡萄糖添加量對抑菌圈直徑的影響Fig.2 Effect of glucose addition on inhibitory zone diameter

由圖2可知，當(dāng)葡萄糖添加量為15 g/L時，抑菌圈直徑最大，為（17.44±0.35）mm，故選擇15 g/L葡萄糖作為最優(yōu)碳源添加量。

2.1.2 氮源種類及添加量的優(yōu)化

圖3 氮源對抑菌圈直徑的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on inhibitory zone diameter

圖4 牛肉膏添加量對抑菌圈直徑的影響Fig.4 Effect of beef extract addition on inhibitory zone diameter

不同氮源對菌株L2的抑菌效果見圖3。由圖3可知，牛肉膏作為氮源時，抑菌圈直徑最大，達(dá)到（18.05±0.26）mm；其次是精氨酸、硫酸銨和硝酸銨，尿素和谷氨酸作為氮源時，抑菌圈直徑較小，故選用牛肉膏作為最適氮源。不同質(zhì)量濃度牛肉膏的抑菌效果見圖4。由圖4可知，當(dāng)牛肉膏添加量為4.5g/L時，抑菌圈直徑達(dá)到（24.59±0.32）mm，故選擇4.5g/L牛肉膏作為最優(yōu)氮源添加量。

2.1.3 無機(jī)鹽種類及添加量的優(yōu)化

不同無機(jī)鹽對巨大芽孢桿菌L2的抑菌效果見圖5。由圖5可知，巨大芽孢桿菌L2對鎂離子、錳離子、鈣離子、磷酸氫二鉀都能較好的利用，而鐵離子則抑制巨大芽孢桿菌的生長[30]，從而影響了其抑菌效果。氯化鈉對L2的抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑達(dá)到（28.48±0.31）mm，故選擇氯化鈉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最適無機(jī)鹽。不同質(zhì)量濃度氯化鈉的抑菌效果見圖6。由圖6可知，氯化鈉添加量為3.0g/L時優(yōu)于其他質(zhì)量濃度，抑菌圈直徑達(dá)到最大，為（29.71±0.27）mm。

圖5 不同無機(jī)鹽對抑菌圈直徑的影響Fig.5 Effects of different inorganic salts on inhibitory zone diameter

圖6 氯化鈉添加量對抑菌圈直徑的影響Fig.6 Effect of sodium chloride addition on inhibitory zone diameter

2.1.4 接種量的優(yōu)化

接種量對菌體生長有影響，所以接種量要適度，不同接種量對抑菌效果的影響如圖7所示。由圖7可知，當(dāng)接種量為6%時，抑菌圈直徑達(dá)到最大，為（24.22±0.50）mm，故選擇最佳接種量為6%。

圖7 接種量對抑菌圈直徑的影響Fig.7 Effect of inoculum on inhibitory zone diameter

2.1.5 初始pH值的優(yōu)化

培養(yǎng)基中pH值會影響細(xì)胞代謝酶活性和營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，進(jìn)而影響微生物生長代謝[31]，初始pH值對抑菌效果的影響如圖8所示。由圖8可知，當(dāng)發(fā)酵初始pH值為7.0時抑菌圈直徑達(dá)到最大，為（27.33±0.26）mm，故選擇發(fā)酵pH=7.0為響應(yīng)面試驗中心試驗點(diǎn)。

圖8 初始pH值對抑菌圈直徑的影響Fig.8 Effect of initial pH value on inhibitory zone diameter

2.1.6 裝液量的優(yōu)化

圖9 裝液量對抑菌圈直徑的影響Fig.9 Effect of loading volume on inhibitory zone diameter

巨大芽孢桿菌是好氧細(xì)菌，低的裝液量使得液體培養(yǎng)基中溶解氧升高，滿足菌體生長和代謝的要求，使得產(chǎn)抗菌物質(zhì)活性提高，不同裝液量對抑菌圈直徑的影響見圖9。由圖9可知，裝液量為50 mL/250 mL時，發(fā)酵液對病原菌抑菌圈直徑為（27.53±0.26）mm，比裝液量為25 mL/250 mL、75mL/250mL、100 mL/250 mL的效果好，故選擇裝液量為50 mL/250 mL。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

通過前期PB試驗、最陡爬坡試驗確定主效應(yīng)因素為牛肉膏、氯化鈉和初始pH值，并以牛肉膏4.58 g/L，氯化鈉3.23 g/L、初始pH值7.0為中心點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計。利用Minitab軟件的Box-Behnken設(shè)計原理，對巨大芽孢桿菌L2培養(yǎng)條件進(jìn)行3因素3水平試驗，選擇牛肉膏（X1）、氯化鈉（X2）、初始pH值（X3）3個因素為自變量，以抑菌圈直徑（Y）為響應(yīng)值，試驗設(shè)計及結(jié)果如表1所示。

表1 巨大芽孢桿菌L2發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of response surface experiments for fermentation conditions optimization ofBacillus megaterium L2

2.2.2 二次回歸模型的建立及檢驗

根據(jù)Minitab軟件得到擬合二階模型公式：Y=34.9533+0.3162X1+0.0812X2+0.0625X3-0.3767X12-0.2567X22-0.4242X32-0.025 0X1X2-0.032 5X1X3+0.012 5X2X3

回歸方程方差顯著性檢驗分析見表2，回歸方程模型P=0.000＜0.01，說明方程擬合度較好；失擬項P=0.122＞0.05，說明失擬不顯著，模型不失擬，選擇合理。根據(jù)表2中F（X1）=261.62，F(xiàn)（X2）=17.27，F(xiàn)（X3）=10.22，說明各因素條件對抑菌圈直徑的影響程度存在差異，各因素影響的主次順序為X1＞X2＞X3，即牛肉膏＞氯化鈉＞初始pH值。X1（牛肉膏）、X2（氯化鈉）、X3（初始pH值）對抑菌圈直徑的線性效應(yīng)顯著，各因素之間交互作用對抑菌圈的交互影響不顯著（P＞0.05），X12（牛肉膏的二次項）、X22（氯化鈉的二次項）、X32（初始pH值的二次項）對抑菌圈的影響極顯著（P＜0.01）。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=99.29%，說明實驗值和預(yù)測值之間有較強(qiáng)的相關(guān)性，校正決定系數(shù)R2adj=98.02%，表明模型擬合較好。

表2 回歸方程的方差分析Table 2 Variance analysis of the regression equation

2.2.3 響應(yīng)曲面的擬合及最優(yōu)條件的確定

固定其中的一個因素，利用Minitab軟件做另外兩個因素交互作用的曲面圖及等值線圖，確定牛肉膏、氯化鈉及初始pH值對抑菌圈直徑的影響。結(jié)果見圖10。

由圖10可知，牛肉膏、氯化鈉、初始pH值相互作用對菌株L2抑菌活性的影響均出現(xiàn)拋物面型關(guān)系，所得到的響應(yīng)面都存在一個極大值點(diǎn)，其中牛肉膏與初始pH值之間的交互作用最為明顯。

經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化，根據(jù)擬合二階模型公式得到理論上的培養(yǎng)基配方為牛肉膏添加量4.58 g/L，氯化鈉添加量3.23 g/L，初始pH值為7.0時，抑菌圈直徑最大為34.77 mm。為了驗證所得到的最佳培養(yǎng)基組成是否可靠，同時考慮了實際操作的可行性，將培養(yǎng)基成分調(diào)整為牛肉膏添加量4.6 g/L、氯化鈉添加量3.0 g/L，初始pH值為7.0，進(jìn)行3次重復(fù)試驗，得到L2抑菌圈直徑為（34.99±0.14）mm，與預(yù)測值34.77 mm擬合度高，說明該模型能很好得模擬和預(yù)測實驗結(jié)果，證實了模型的有效性。

圖10 牛肉膏、氯化鈉和初始pH值交互作用對抑菌圈大小影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.10 Response surface plots and contour lines of effects of interactions between beef extract,NaCl and initial pH value on inhibitory zone diameter

3 結(jié)論

本試驗以病原真菌鏈格孢菌為指示菌，在單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對巨大芽孢桿菌L2抗菌性能的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，結(jié)果得到最優(yōu)發(fā)酵條件：葡萄糖添加量15 g/L，牛肉膏添加量4.6 g/L，氯化鈉添加量3.0 g/L，初始pH為7.0，裝液量50 mL/250 mL，接種量6%，優(yōu)化后發(fā)酵液抑菌圈直徑為（34.99±0.14）mm，比原始發(fā)酵條件下的抑菌圈直徑為（14.55±0.43）mm提高了140.48%。試驗篩選出牛肉膏、氯化鈉和初始pH值為主效應(yīng)因素，說明培養(yǎng)基成分與酸堿性對菌株L2產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響較顯著，為后續(xù)進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件和投入生產(chǎn)提供依據(jù)。但本研究是在實驗室搖瓶條件下進(jìn)行，要實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模開發(fā)生產(chǎn)，還需進(jìn)一步培養(yǎng)工藝的研究。