羊 希，李 霞，余 康，廖學(xué)品，2，3*，石 碧，2，3

（1.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610065；2.四川大學(xué) 皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065；3.四川大學(xué) 制革清潔技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610065）

羽毛是一種豐富的可再生生物質(zhì)資源。據(jù)報(bào)道，中國(guó)的家禽加工廠每年大約產(chǎn)生幾百萬(wàn)t的羽毛副產(chǎn)物[1]。羽毛中含有大量的蛋白質(zhì)，其中角蛋白是廣泛存在于羽毛中的一種硬性蛋白，該蛋白富含色氨酸、谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸等[2]，營(yíng)養(yǎng)十分豐富。然而，目前羽毛資源并未得到合理有效的利用，大部分作為廢棄物，不僅浪費(fèi)資源，而且有可能造成環(huán)境污染。

傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法降解羽毛會(huì)破壞角蛋白中一些必需氨基酸，如甲硫氨酸、賴氨酸和色氨酸等，這類方法不僅生產(chǎn)成本高，而且還會(huì)帶來(lái)一系列環(huán)境污染問(wèn)題[3]。相對(duì)而言，生物降解廢棄羽毛更加綠色環(huán)保。但羽毛的組成結(jié)構(gòu)特殊，主要由α-角蛋白（α-螺旋）或β-角蛋白（β-折疊）中的多肽鏈緊密堆積而成，其內(nèi)部的半胱氨酸二硫鍵可作為連接橋形成復(fù)雜的交聯(lián)網(wǎng)[4]。因此，羽毛難以被木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶等常見的蛋白酶所降解[5]。有研究報(bào)道，利用微生物降解羽毛后可以增強(qiáng)羽毛的消化率和可溶性，提高羽毛的利用價(jià)值[6]。自然界中可以降解羽毛角蛋白的微生物較多，主要包括細(xì)菌類的芽孢桿菌屬（Bacillussp.）[7-8]、真菌類的曲霉屬（Aspergillussp.）[9]、放線菌的鏈霉菌屬（Streptomycessp.）[10]。但是采用微生物降解羽毛通常會(huì)面臨蛋白酶酶活低和降解羽毛時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，使得羽毛的利用程度較低，不能得到有效地資源化應(yīng)用。因此，需要尋找和開發(fā)能高效降解羽毛廢棄物的降解菌。

目前，我國(guó)對(duì)羽毛降解的研究基本停留在角蛋白酶菌的分離、篩選及角蛋白酶作用機(jī)制的初步研究上，而角蛋白酶具有廣闊的應(yīng)用前景使得角蛋白酶倍受關(guān)注。利用羽毛角蛋白酶降解羽毛轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白、多肽和氨基酸來(lái)豐富飼料的營(yíng)養(yǎng)[11]；角蛋白酶應(yīng)用于皮革脫毛[12-13]；洗滌劑工業(yè)中添加角蛋白酶[14]，達(dá)到快速清除血跡的作用；利用角蛋白酶降解羽毛，將有機(jī)氮輸入農(nóng)業(yè)土壤作為重要化肥原料等[15]。

Keratinibaculum paraultunens是從養(yǎng)雞場(chǎng)附近土壤中分離得到的一株厭氧細(xì)菌，具有高效降解角蛋白的能力，可有效打破好氧細(xì)菌降解角蛋白時(shí)溶解氧的局限。本研究利用角蛋白降解菌K.paraultunense發(fā)酵雞羽毛，考察了菌株對(duì)羽軸、羽枝和羽片的降解特性；探究了不同培養(yǎng)基對(duì)該菌發(fā)酵產(chǎn)物的影響；此外，還研究了在羽毛底物不同添加量的情況下該菌的發(fā)酵性能。為進(jìn)一步掌握K.paraultunense對(duì)雞羽毛的降解特性及產(chǎn)角蛋白酶、可溶性蛋白特性，以及雞羽毛的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

角蛋白降解菌株Keratinibaculum paraultunense：綿陽(yáng)禾本生物工程有限公司。

1.1.2 雞毛

在當(dāng)?shù)卮笮图仪萃涝讏?chǎng)收集雞毛，經(jīng)過(guò)洗滌劑清洗，自來(lái)水反復(fù)沖洗后121℃滅菌30 min，80℃烘干至恒質(zhì)量后，將羽片（the whole feather，C）分為羽軸（feather rachis，A）和羽枝（feather barblues，B）（見圖1），將三者分別用切割研磨機(jī)進(jìn)行粉碎并過(guò)25目篩子，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 羽毛的構(gòu)成部分Fig.1 Composition of feathers

1.1.3 化學(xué)試劑

氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、尿素（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂（分析純）、L-半胱氨酸鹽酸鹽（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；茚三酮（分析純）、考馬斯亮藍(lán)（分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；牛血清蛋白（純度≥98%）：上海伯奧生物科技有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

全培養(yǎng)基（I）、無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（II）和純水培養(yǎng)基（III）的組分濃度如表1所示，初始pH值為8.0，培養(yǎng)基分裝到厭氧瓶，厭氧瓶裝液量為100 mL/250 mL。121℃滅菌30 min。

表1 實(shí)驗(yàn)所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方Table 1 Formula of fermentation medium used in the research g/L

1.2 儀器與設(shè)備

SM100切割研磨機(jī)：德國(guó)萊馳公司；UV-1800PC紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；A300型自動(dòng)氨基酸分析儀：德國(guó)MembraPure GmbH公司；HYQX-II厭氧培養(yǎng)箱、HH·B11-BS-II電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 角蛋白降解菌發(fā)酵廢棄羽毛

將活化好的角蛋白降解菌以1%的接種量接入含有1%羽片的全培養(yǎng)基中，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定較佳的pH值為8.0，溫度為55℃，厭氧培養(yǎng)72 h，在此條件下進(jìn)行發(fā)酵并觀察羽片的降解過(guò)程。

1.3.2 羽片降解特性分析

將粉碎后的羽軸、羽枝和羽片分別加入1%于全培養(yǎng)基中，活化好的菌液添加量為1%，55℃培養(yǎng)72 h，每間隔12 h取適量的發(fā)酵液，并將其離心（12 000 r/min、10 min），取上清液，分別測(cè)定其游離氨基酸總量、角蛋白酶的酶活力、pH和可溶性蛋白含量，并分析發(fā)酵過(guò)程中羽毛降解率的變化。

（1）游離氨基酸的測(cè)定

取適量的發(fā)酵液離心，將上清液與10%的磺基水楊酸按4∶1混合均勻，經(jīng)0.22 μm微孔膜過(guò)濾后，將過(guò)濾液放置于4℃的冰箱冷藏1 h，離心取上清液，用樣品稀釋液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，最后由0.22μm過(guò)濾器再次過(guò)濾后上氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定[16]。

（2）角蛋白酶酶活的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[17]方法略有改進(jìn)：以酪蛋白為底物，實(shí)驗(yàn)組取1.5 mL酪蛋白底物（10.0 g/L，pH 7.5）于離心管中，加入1.0 mL粗酶液（發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心5 min，上清液即為粗酶液），80℃條件下恒溫水浴反應(yīng)10 min，加10%三氯乙酸1.0 mL終止反應(yīng)；對(duì)照組取1.0 mL粗酶液于試管中，加入1.0mL10%三氯乙酸，80℃條件下恒溫水浴反應(yīng)10min，反應(yīng)終止時(shí)加1.5mL酪蛋白底物。將反應(yīng)產(chǎn)物于12000r/min條件下離心10min，取上清液測(cè)定其波長(zhǎng)280nm處的吸光度值。

角蛋白酶酶活定義：在pH值為7.5，溫度為80℃的條件下，每1.0 mL酶液反應(yīng)10 min后，A280nm每增加0.01為一個(gè)酶活單位（U/mL）。

（3）可溶性蛋白含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中可溶性蛋白的含量[18]，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確配制0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，將5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液與上述牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液充分混合，室溫下反應(yīng)5 min后，測(cè)定其在波長(zhǎng)595nm處的吸光度值，每組做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。以牛血清蛋白質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制出牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=6.7960x+0.0119 5（相關(guān)系數(shù)R2為0.998），根據(jù)回歸方程，計(jì)算樣品中可溶性蛋白含量。

（4）羽毛降解率的計(jì)算

式中：W1為發(fā)酵前添加的干羽毛質(zhì)量，g；W2為發(fā)酵后未降解羽毛干燥至恒質(zhì)量的殘?jiān)|(zhì)量，g。

1.3.3 不同培養(yǎng)基對(duì)羽片降解過(guò)程的影響

將10 g/L粉碎的羽片分別加入全培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基和純水培養(yǎng)基中，55℃培養(yǎng)72 h，每間隔12 h取發(fā)酵液離心，測(cè)定上清液中游離氨基酸總量、酶活、pH和可溶性蛋白含量，并分析發(fā)酵過(guò)程中羽片降解率的變化。

1.3.4 羽片添加量對(duì)角蛋白降解菌發(fā)酵性能的影響

將活化好的角蛋白降解菌以5%的接種量分別加入含有10 g/L、50 g/L、100 g/L、150 g/L和200 g/L羽片底物的全培養(yǎng)基中，于55℃條件下培養(yǎng)48 h，測(cè)定各發(fā)酵液的角蛋白酶酶活和可溶性蛋白含量，以考察羽片底物的添加量對(duì)角蛋白降解菌發(fā)酵性能的影響。

此外，選取含有100 g/L羽片的全培養(yǎng)基為研究對(duì)象，接入5%活化好的角蛋白降解菌，于55℃培養(yǎng)84 h，從24 h開始，每12 h取10 mL發(fā)酵液離心，測(cè)定上清液中角蛋白酶酶活和可溶性蛋白含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次，采用SSPS 18軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Origin Pro 8.5繪圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著性差異P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 角蛋白降解菌對(duì)羽片的降解

羽片添加量為10 g/L，活化好的角蛋白降解菌接種量為1%，培養(yǎng)基為表1中的I號(hào)培養(yǎng)基，發(fā)酵條件如1.3.1所述。角蛋白降解菌對(duì)羽片的降解過(guò)程如圖2所示。

由圖2可知，一根完整的羽片在發(fā)酵24 h后，羽枝被完全降解，而羽軸經(jīng)過(guò)48 h才被降解完全，可見，羽軸的降解要比羽枝難一些，主要是因?yàn)橛鹬陀疠S的本身的化學(xué)特性存在一定的差異，而且羽軸的比表面積較羽枝小，因此與角蛋白降解菌的接觸面積更少，從而增大了降解的難度[19]。

圖2 Keratinibaculum paraultunense在全培養(yǎng)基中降解羽片的過(guò)程Fig.2 Degradation process of pinna byKeratinibaculum paraultunensein the whole medium

2.2 羽毛不同部位的降解特性

TESFAYE T等[20]對(duì)羽軸和羽枝的形態(tài)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)羽軸和羽枝屬于一種蛋白纖維，具有低密度、高柔韌和中空蜂窩結(jié)構(gòu)等特性。將培養(yǎng)基中的羽毛底物設(shè)置為羽軸、羽枝和羽片，這三者的添加量均為10g/L，活化好的角蛋白降解菌接種量為1%，培養(yǎng)基為表1中I號(hào)培養(yǎng)基，發(fā)酵條件如1.3.2所述，對(duì)羽毛不同部位的降解特性進(jìn)行研究，結(jié)果如圖3所示。羽軸、羽枝和羽片在被K.paraultunense降解時(shí)的降解率隨時(shí)間的變化如圖3a所示。由圖3a可知，菌株在全培養(yǎng)基中對(duì)三者的降解率，羽軸、羽枝和羽片在24 h時(shí)就可達(dá)到95%，而三者在36 h羽毛的降解率達(dá)到98%，與未粉碎的羽片（見圖2，36 h時(shí)還殘留較多的羽軸）相比，發(fā)酵效率明顯提高?？梢姡瑢⒂鹌M(jìn)行粉碎后，可以在一定的程度上加速羽片的降解，同時(shí)，粉碎羽片后，可以減小羽軸和羽枝在降解率上的差距。

角蛋白酶的酶活隨時(shí)間的變化結(jié)果如圖3b所示。由圖3b可知，從整體上看，發(fā)酵過(guò)程中角蛋白酶的酶活均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，0～12 h角蛋白酶酶活升高緩慢，這可能是此階段的角蛋白降解菌處于適應(yīng)期，從而使得菌株產(chǎn)角蛋白酶較少；在48h時(shí)，該菌發(fā)酵羽軸、羽枝和羽片所產(chǎn)的角蛋白酶的酶活均達(dá)到最高，分別為羽軸5174U/mL、羽枝6 776U/mL和羽片5456U/mL?？梢姡摼瓴粌H對(duì)羽片降解率高，所產(chǎn)的角蛋白酶的酶活也可達(dá)到較高的水平，是一種能高效降解羽片的微生物[21]。

由圖3c和3d可知，可溶性蛋白含量和游離氨基酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間增加在不斷積累，在24 h時(shí)，含量已達(dá)到最大，隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，24 h至48 h可溶性蛋白含量基本維持一個(gè)穩(wěn)定值，48 h后可溶性蛋白含量開始逐漸下降，而游離氨基酸總量在24 h后逐漸下降。這可能是因?yàn)榫暝?4 h時(shí)羽片的降解率接近95%，羽片基本被降解完全，而菌株為維持自身生長(zhǎng)代謝需要消耗大量的可溶性蛋白和游離氨基酸，可溶性蛋白的分子量較游離氨基酸大，因此游離氨基酸更易、更快被菌體利用[22]。其中，羽軸在全培養(yǎng)基中產(chǎn)生的游離氨基酸總量最多，而產(chǎn)生的可溶性蛋白含量最低，這可能是由于在羽軸作為底物的培養(yǎng)基中，角蛋白降解菌進(jìn)一步將可溶性蛋白轉(zhuǎn)化為游離氨基酸。這表明，該菌在發(fā)酵羽軸和羽枝產(chǎn)可溶性蛋白和游離氨基酸上是有區(qū)別的，而從整體上看，粉碎后的羽片具備羽枝和羽軸的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明羽片經(jīng)過(guò)粉碎后，可有效解決羽軸較羽枝難降解這一問(wèn)題，并且菌株可產(chǎn)生大量的可溶性蛋白和游離氨基酸。

圖3 Keratinibaculum paraultunense在全培養(yǎng)基中對(duì)降解羽軸（A）、羽枝（B）和羽片（C）的影響Fig.3 Effect ofKeratinibaculum paraultunenseon the degradation of pinna rachis(A),barbs(B)and pinna(C)over time in the whole medium

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)羽片降解過(guò)程的影響

采用表1中的I、II和III三種培養(yǎng)基，選定羽片為發(fā)酵底物，活化好的角蛋白降解菌接種量為1%，其他發(fā)酵條件如1.3.3所述，研究了不同培養(yǎng)基對(duì)羽片降解過(guò)程的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4a可知，培養(yǎng)基I、II和III中的酶活大小有明顯的差別。其中，III為純水培養(yǎng)基，羽片是微生物發(fā)酵唯一的碳和氮來(lái)源，而整個(gè)培養(yǎng)階段III中的酶活保持在50U/mL左右，這進(jìn)一步表明該菌株是可以產(chǎn)生角蛋白酶的。但是，與I和II培養(yǎng)基相比，培養(yǎng)基III中的角蛋白酶的酶活是最低的，可見純水培養(yǎng)基不利于該菌株產(chǎn)角蛋白酶。與培養(yǎng)基II相比，培養(yǎng)基I中K.paraultunense所產(chǎn)的角蛋白酶的酶活較高，且達(dá)到最高酶活時(shí)間比II所需時(shí)間少，在48 h時(shí)，培養(yǎng)基I中K.paraultunense所產(chǎn)的角蛋白酶的酶活可達(dá)到最大值5 449 U/mL，而II中前24 h酶活都非常低，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基II中，只含無(wú)機(jī)鹽和羽片，因此菌株生長(zhǎng)遲緩，需要較長(zhǎng)的時(shí)間適應(yīng)外部環(huán)境。而培養(yǎng)基I中，除了培養(yǎng)基II所包含的成分外，還添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽和尿素這兩種有機(jī)氮源，可以促進(jìn)這株厭氧型角蛋白降解菌快速生長(zhǎng)，增強(qiáng)該菌產(chǎn)角蛋白酶的能力，從而提高該菌的發(fā)酵效率[25]。該菌株接種在培養(yǎng)基I、II和III的產(chǎn)酶能力的順序是培養(yǎng)基I＞II＞III。

發(fā)酵過(guò)程中菌株所產(chǎn)的角蛋白酶的酶活會(huì)直接影響羽片降解率[26]。由圖4b可知，自發(fā)酵開始至24 h，菌株在培養(yǎng)基I和II中羽片降解率不斷增大，24 h以后基本降解，最終羽片降解率在98%左右。但前24h，培養(yǎng)基I中的羽片降解率比II中的高，很可能是菌株在培養(yǎng)基I中有可直接利用碳源和氮源，所以在培養(yǎng)基I中菌株降解羽片比培養(yǎng)基II更快。而在培養(yǎng)基III中菌株降解羽片的最終降解率非常低，在72 h，只有30%的羽片被降解，這表明這株厭氧菌能在純水做培養(yǎng)基的條件下，產(chǎn)生酶和降解部分羽片，進(jìn)一步驗(yàn)證了該菌株具備產(chǎn)角蛋白酶的能力。三種培養(yǎng)基中的羽片降解率由大到小依次為培養(yǎng)基I＞II＞III。

發(fā)酵過(guò)程中可溶性蛋白含量和游離氨基酸總量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而變化，結(jié)果見圖4c和4d。由圖4c和4d可知，培養(yǎng)基III中的游離氨基酸總量非常少，而I中的游離氨基酸總量在24h達(dá)到最大值1.06mg/mL，培養(yǎng)基II中的游離氨基酸總量在48 h達(dá)到峰值0.85 mg/mL。由表1可知，培養(yǎng)基II的成本明顯低于I。值得注意的是，雖然培養(yǎng)基I中角蛋白酶的酶活和游離氨基酸的總量整體上要比培養(yǎng)基II中的高，但培養(yǎng)基II中可溶性蛋白達(dá)到的最大含量明顯比I中高，在36 h時(shí)，培養(yǎng)基II中可溶性蛋白的含量高達(dá)0.93 mg/mL，而培養(yǎng)基I中最大可溶性蛋白含量是0.69 mg/mL。這可能是在培養(yǎng)基I中，主要以產(chǎn)角蛋白酶為主，其酶活較高，且培養(yǎng)基I中游離氨基酸含量較高；而在培養(yǎng)基II中，主要是以產(chǎn)可溶性蛋白為主，其可溶性蛋白含量高?？梢?，降解羽片的過(guò)程中，培養(yǎng)基的種類對(duì)該菌的發(fā)酵性能影響較大，全培養(yǎng)基更適合產(chǎn)角蛋白酶，而無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基更有利于得到高濃度的可溶性蛋白。

圖4 在不同種類的培養(yǎng)基對(duì)廢棄羽片降解過(guò)程的影響Fig.4 Effect of different medium on degradation process of waste feathers

2.4 羽片添加量對(duì)角蛋白降解菌發(fā)酵性能的影響

基于以上的研究，可以發(fā)現(xiàn)該菌株具有高效降解羽片的能力。因此本文考察了羽片底物的添加量對(duì)角蛋白降解菌發(fā)酵性能的影響。當(dāng)羽片添加量為10 g/L，活化好的菌液添加量為1%，選擇表1中的I號(hào)培養(yǎng)基，其他發(fā)酵條件如1.3.4所述，結(jié)果如圖5所示。

圖5 Keratinibaculum paraultunense在全培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h時(shí)羽片添加量對(duì)角蛋白酶酶活和可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effect of feathers addition on keratinase activity and soluble protein contents byKeratinibaculum paraultunense fermented for 48 h in the whole medium

由圖5可知，角蛋白酶的相對(duì)酶活力和可溶性蛋白含量隨羽片底物質(zhì)量濃度在0～200 g/L范圍內(nèi)的增加而先增大后降低。其中當(dāng)羽片添加量為50 g/L，酶活達(dá)到最大，為11 520 U/mL；而當(dāng)羽片添加量為100 g/L，可溶性蛋白含量達(dá)到最高為1.58 mg/mL。而當(dāng)羽片底物添加量過(guò)高時(shí)，角蛋白酶的酶活和可溶性蛋白的含量反而降低。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中羽片濃度過(guò)高，會(huì)使得發(fā)酵液變得黏稠，影響微生物與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間的傳質(zhì)過(guò)程，從而影響角蛋白酶和可溶性蛋白的生成。

當(dāng)羽片添加量為100 g/L時(shí)，角蛋白酶酶活和可溶性蛋白含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化如圖6所示。

圖6 Keratinibaculum paraultunense在全培養(yǎng)基中發(fā)酵84 h時(shí)角蛋白酶酶活和可溶性蛋白含量（a）及降解羽片的過(guò)程（b）Fig.6 Keratinase activity and soluble protein content(a),the degradation process of feathers(b)byKeratinibaculum paraultunensefermented for 84 h in the whole medium

由圖6a可知，發(fā)酵48 h得到最大酶活為11 179 U/mL，而發(fā)酵36h得到最大可溶性蛋白含量為1.83mg/mL。與圖4a和4b相比，發(fā)現(xiàn)羽片的添加量和菌種接種量提高到100 g/L和5%時(shí)，菌株所產(chǎn)角蛋白酶的酶活和產(chǎn)可溶性蛋白的濃度都提高了兩倍左右?？梢?，該菌可以利用高濃度的羽片廢棄物，并產(chǎn)生大量的可溶性蛋白和角蛋白酶。此外，不同發(fā)酵時(shí)間段的羽片降解情況如圖6b所示。由圖6b可知，即使在羽片濃度較高的條件下，該菌株仍然可以對(duì)其高效降解，這表明該菌株可以達(dá)到較大的發(fā)酵負(fù)荷。

3 結(jié)論

角蛋白降解菌（Keratinibaculum paraultunense）在厭氧條件下通過(guò)微生物發(fā)酵對(duì)廢棄羽片的不同部位進(jìn)行了降解分析，研究發(fā)現(xiàn)，羽軸比羽枝更難被降解，羽軸經(jīng)粉碎后，降解效果較好。采用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)，主要降解產(chǎn)物是可溶性蛋白，含量可達(dá)0.93 mg/mL。采用全培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)，主要發(fā)酵產(chǎn)物是角蛋白酶和游離氨基酸，當(dāng)羽片底物量提高到100 g/L，角蛋白酶的酶活高達(dá)11 179 U/mL。角蛋白降解菌能快速高效地降解高濃度的廢棄羽片，可生產(chǎn)大量的可溶性蛋白和高活力的角蛋白酶。本研究具有較好的應(yīng)用前景。可溶性蛋白和游離氨基酸可豐富飼料營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)可溶性蛋白作為填充劑應(yīng)用到皮革，能賦予皮革較好的柔軟性和豐滿性，而高活力的角蛋白酶可應(yīng)用到皮革脫毛以及醫(yī)藥等行業(yè)。