尹金鳳，李泓全，吳欣森*

（上?；ぱ芯吭河邢薰荆虾?200062）

脂肪酶（EC3.1.1.3 lipase）又稱為三?；视王ニ饷福且环N非常重要的酯鍵水解酶[1]，在醫(yī)藥、食品、皮革和洗滌劑等[2-4]工業(yè)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。近年來(lái)，隨著異相系統(tǒng)酶學(xué)和非水相酶學(xué)的發(fā)展，脂肪酶在手性化合物光學(xué)拆分等醫(yī)藥中間體合成領(lǐng)域也顯示了巨大的潛力[5-7]。相較于化學(xué)合成，酶法合成具有條件溫和，底物專一性強(qiáng)，產(chǎn)物純度高等優(yōu)點(diǎn)[8]，酶法拆分的優(yōu)勢(shì)日趨明顯。

脂肪酶廣泛存在于微生物、植物和動(dòng)物組織中，尤其是各種微生物，如細(xì)菌、放線菌、酵母等[9-10]。粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）能夠產(chǎn)生胞外脂肪酶[11]，可以用于地爾硫卓醫(yī)藥中間體（±）-對(duì)甲氧基苯基縮水甘油酸甲酯（methyl2R，3S-（-）-3-（4-methoxyphenyl）oxiranecarboxylate，（±）MPGM）酶法拆分[12-13]，但是目前其產(chǎn)生的胞外脂肪酶活性較低。LIXY等[14]從λ噬菌體基因文庫(kù)中克隆了S.marcescens SM6編碼脂肪酶的基因，并在JM109（DE3）中獲得了表達(dá)，但是表達(dá)量只達(dá)到野生菌的水平，大多為失活的包涵體；LONG Z D等[15]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增的方法克隆了S.marcescensECU1010的脂肪酶基因，同時(shí)在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中獲得了表達(dá)，在培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基優(yōu)化后，脂肪酶活性達(dá)到5 000～6 000 U/L，但是可溶的活性酶蛋白僅占30%。

傳統(tǒng)隨機(jī)突變文庫(kù)構(gòu)建過程復(fù)雜，涉及雙酶切、回收、連接和轉(zhuǎn)化等多個(gè)步驟，效率低下，大引物全質(zhì)粒法（megaprimer PCR of whole plasmid，MEGAWHOP）法[16-17]通過兩步PCR即可獲得突變體文庫(kù)，省去了脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）純化步驟，是一種比較快速有效的隨機(jī)突變方法[18]。但由于MEGAWHOP法以隨機(jī)突變后的目標(biāo)基因作為雙鏈互補(bǔ)的引物對(duì)（Megaprimers），所用的特大引物必須針對(duì)目標(biāo)基因及易錯(cuò)條件特別制備，故MEGAWHOP法一般適用于500～1 000 bp大小的目的基因的隨機(jī)突變[17]，隨著引物對(duì)長(zhǎng)度的增加，MEGAWHOP法PCR擴(kuò)增難度也隨之增大，PCR產(chǎn)物獲得率明顯下降。為進(jìn)一步豐富脂肪酶基因（lipA，大小1 845 bp）庫(kù)，獲得更高活力的脂肪酶重組菌株，本實(shí)驗(yàn)室擬首先通過常規(guī)分子生物學(xué)手段[19]，實(shí)現(xiàn)將粘質(zhì)沙雷氏菌（S.marcescensCGMCC14850）來(lái)源的脂肪酶基因sm-lipA在大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）中成功表達(dá)，采用MEGAWHOP法隨機(jī)突變大腸桿菌脂肪酶重組菌株，構(gòu)建突變文庫(kù)，獲得優(yōu)勢(shì)突變株，并對(duì)突變菌株的誘導(dǎo)條件[20-22]及可溶蛋白的釋放進(jìn)行了相關(guān)研究，以期獲得高產(chǎn)脂肪酶的突變株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）CGMCC14850：本實(shí)驗(yàn)室保藏；大腸桿菌（Escherichiacoli）BL21和DH5α：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；質(zhì)粒pET32a（+）：生物風(fēng)公司。

1.1.2 試劑

DNAMarker、DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒：上海捷瑞生物工程有限公司；瓊脂糖、Goldview、TaqDNA聚合酶（5U/mL）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactoside，IPTG）、DpnⅠ限制性內(nèi)切酶（10 U/μL）：上海生工生物工程有限公司；PCR引物合成及測(cè)序委托上海生工生物工程有限公司；pfu DNA聚合酶（25 U/μL）：上海浩然生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基

Luria-Bertan（LB）液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%、酵母膏0.5%、NaCl 1%，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基/氨芐青霉素（ampicillin，Amp）瓊脂平板：在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂2%，121℃滅菌20 min，終質(zhì)量濃度100μg/mL的氨芐青霉素。

1.2 儀器與設(shè)備

UV755B紫外分光光度計(jì)：上海分析儀器廠；JY92-Ⅱ超聲波破碎儀：寧波新芝科學(xué)儀器所；CSB-2潔凈工作臺(tái)：上海凈化設(shè)備廠；HYG-Ⅱ回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海新星自控設(shè)備廠；T100 PCR儀：美國(guó)BIO-RAD公司；BG-T0520全自動(dòng)凝膠成像儀：北京百晶生物技術(shù)有限公司；FD201穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀：上海醫(yī)用分析廠；GHP-9080N隔水式培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；PL2002電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；THD-0506低溫恒溫槽：寧波天恒儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶重組菌株SRI-01的分子構(gòu)建

參照文獻(xiàn)[19]中的常規(guī)分子構(gòu)建方法，按照美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（nationalcenterofbiotechnologyinformation，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中脂肪酶lipA的核酸序列設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)引物：上游引物5'-CGCGGATCCATGGGCATCTTTAGCTATAAG-3'（10 μmol/L）和下游引物5'-CCCAAGCTTTTAGGCCAA CACCACCTGAT-3'（10 μmol/L），對(duì)來(lái)源于沙雷氏菌S.marcescensCGMCC 14850的脂肪酶基因進(jìn)行分子克隆，并將擴(kuò)增得到的目的片段和pET-32a（+）質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切反應(yīng)（BamHI-HindIII組合），雙酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定脂肪酶活性。將此重組菌株命名為SRI-01。

1.3.2 隨機(jī)突變法改造重組菌株SRI-01

易錯(cuò)PCR（error-pronepolymerasechainreaction，ep-PCR）建立隨機(jī)突變庫(kù)：以重組菌株SRI-01質(zhì)粒為模板，上游引物5'-CGCGGATCCATGGGCATCTTTAGCTATAAG-3'（10 μmol/L）和下游引物5'-CCCAAGCTTTTAGGCCAA CA CCACCTGAT-3'（10μmol/L）分別為上下游引物進(jìn)行50 μL體系的易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變庫(kù)擴(kuò)增，并設(shè)置錳離子Mn2+濃度梯度（0.05mmol/L、0.10mmol/L、0.15mmol/L、0.20mmol/L、0.30 mmol/L）控制突變庫(kù)頻率。

以純化后的ep-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為Megaprimer，重組菌株SRI-01質(zhì)粒（pET32a-LipA，7 745 bp）為模板，參照MEGAWHOP[16]法進(jìn)行全質(zhì)粒PCR擴(kuò)增，將LipA基因的ep-PCR產(chǎn)物Megaprimer直接擴(kuò)增至pET32a表達(dá)載體；在MEGAWHOP法擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中加入DpnⅠ限制性內(nèi)切酶，專一性消化甲基化序列GATC，37℃條件下水浴反應(yīng)2 h徹底降解原始模板；轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），涂布于LB培養(yǎng)基/氨芐青霉素瓊脂平板，直至轉(zhuǎn)化子形成。

96孔板高通量篩選隨機(jī)突變庫(kù)：采用欒政嬌[23]建立的96孔板高通量篩選模型對(duì)隨機(jī)突變庫(kù)進(jìn)行篩選。

1.3.3 脂肪酶活力測(cè)定

脂肪酶活力的測(cè)定按照文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行。移取100μL酶液，加入2.87 mL磷酸鉀緩沖液中（100 mmol/L，pH 7.5），30℃預(yù)保溫3min后，加入30 μL對(duì)硝基苯酚乙酸酯（p-nitrophenyl acetate，pNPA）的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液（100 mmol/L），使其終濃度為1 mmol/L，于波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定對(duì)硝基苯酚吸光度值的增長(zhǎng)速率。

脂肪酶活力的定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘生成1.0 μmol對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）所需要的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

相對(duì)酶活：以最高酶活力為100%，其他與之相對(duì)百分比值為相對(duì)酶活。

1.3.4 脂肪酶突變菌株誘導(dǎo)條件優(yōu)化

誘導(dǎo)前的菌體生物量的確定：將突變優(yōu)勢(shì)菌株取5 μL菌液接種至LB/Amp培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h，再轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基（添加100 μg/mL Amp）中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)1.50 h、1.75 h、2.00 h、2.25 h、2.50 h、2.75 h、3.00 h、3.25 h，進(jìn)行IPTG（0.1 mmol/L）誘導(dǎo)，同時(shí)加入CaCl2（3 mmol/L），16℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，濃縮重懸，進(jìn)行超聲波破碎，離心得到上清液，波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定吸光度值，得到相對(duì)酶活。

誘導(dǎo)劑IPTG濃度和CaCl2濃度的優(yōu)化：將突變優(yōu)勢(shì)菌株取5 μL菌液接種至LB/Amp培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h，再轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基（添加100 μg/mL Amp）中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)一段時(shí)間，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，同時(shí)加入CaCl2，考察條件：誘導(dǎo)劑IPTG終濃度：0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.20 mmol/L、0.50mmol/L、1.00mmol/L；CaCl2終濃度：1mmol/L、2mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L、5 mmol/L。16℃、180 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，濃縮重懸，進(jìn)行超聲波破碎，離心得到上清液，在波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定吸光度值，得到相對(duì)酶活。

脂肪酶突變菌株誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化：將突變優(yōu)勢(shì)菌株取5 μL菌液接種至LB/Amp培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h，再轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基（添加100 μg/mL Amp）中，37℃、180 r/min培養(yǎng)一段時(shí)間，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，同時(shí)加入CaCl2，隨后分別置于12℃、16℃、20℃、25℃、30℃、37℃180r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，濃縮重懸，進(jìn)行超聲波破碎，離心得到上清液，波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定吸光度值，得到相對(duì)酶活。

1.3.5 破碎緩沖液pH對(duì)突變菌株脂肪酶活力的影響

在誘導(dǎo)突變菌表達(dá)重組蛋白后，采用超聲波破碎細(xì)胞，采用冰浴，400 W，破2 s停6 s，99次，將破碎液10 500 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行脂肪酶活力測(cè)定。考察超聲時(shí)不同pH破碎緩沖液對(duì)細(xì)胞破碎的效果，配制不同pH（6.5～9.0）的緩沖液（10mmol/L磷酸鈉緩沖體系下），分別測(cè)定突變株在對(duì)應(yīng)pH條件下破碎的脂肪酶活力。

1.3.6 破碎緩沖液離子濃度對(duì)突變菌株脂肪酶活力的影響

在誘導(dǎo)突變菌表達(dá)重組蛋白后，采用超聲波破碎細(xì)胞，采用冰浴，400 W，破2 s停6 s，99次，將破碎液10 500 r/min離心15min，取上清液進(jìn)行脂肪酶活力測(cè)定。考察超聲時(shí)不同破碎緩沖液離子對(duì)細(xì)胞破碎的效果，磷酸鉀緩沖液和磷酸鈉緩沖液的濃度分別為1 mmol/L、2 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L，Tris-HCl緩沖液濃度為0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L，以純水作為空白對(duì)照，分別測(cè)定突變菌株在不同破碎緩沖液離子濃度條件下脂肪酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶重組菌株SRI-01的分子構(gòu)建

采用常規(guī)分子構(gòu)建方法，從沙雷氏菌中提取脂肪酶目的基因片段，經(jīng)過PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn)證（見圖1），與lipA基因大小吻合，為1 845 bp。隨后將目的基因與載體pET-32a（+）連接，轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)脂肪酶基因一致，將此陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為SRI-01，通過對(duì)重組菌進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，測(cè)定脂肪酶活性為31 163 U/L。

圖1 沙雷氏菌脂肪酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證Fig.1 Agarose gel electrophoresis validation of PCR amplification products of lipase genelipAfromSerratia marcescens

2.2 隨機(jī)突變法改造重組菌株SRI-01

2.2.1 易錯(cuò)PCR建立隨機(jī)突變庫(kù)

以重組菌株SRI-01為模板，易錯(cuò)PCR進(jìn)行隨機(jī)突變擴(kuò)增，設(shè)置0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.15 mmol/L、0.20 mmol/L、0.30mmol/LMn2+濃度梯度以控制突變庫(kù)頻率，如圖2A所示。

圖2 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證Fig.2 Agarose gel electrophoresis validation of ep-PCR amplification products

由圖2A可知，隨著Mn2+濃度的升高，易錯(cuò)PCR擴(kuò)增效率也逐漸降低，當(dāng)Mn2+濃度＞0.15 mmol/L時(shí)，ep-PCR產(chǎn)物未出現(xiàn)目的條帶（大小為1 845 bp），高濃度的Mn2+濃度可能抑制了TaqDNA聚合酶的活性[24]。

分別挑選0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.15 mmol/L Mn2+濃度條件下獲得的克隆子進(jìn)行測(cè)序，并測(cè)定具有脂肪酶活力的突變株所占比例。結(jié)果證明，0.1mmol/LMn2+濃度下的隨即突變擴(kuò)增可以使脂肪酶的氨基酸序列產(chǎn)生1～3個(gè)突變，此濃度適于進(jìn)一步的高通量篩選。故選用0.1 mmol/L Mn2+濃度條件下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行MEGAWHOP法PCR擴(kuò)增。

由于MEGAWHOP法一般適用于500～1 000 bp大小的基因隨機(jī)突變，片段過長(zhǎng)將影響與質(zhì)粒的連接效率，通過選用不同濃度配比的突變引物Megaprimer和質(zhì)粒pET32a-LipA，最終在兩者濃度配比為0.5 μg∶0.05 μg時(shí)，獲得分子質(zhì)量為7 745 bp的目標(biāo)MEGAWHOP-PCR產(chǎn)物（見圖2B），其與理論值相符合。

2.2.2 96孔板高通量篩選重組菌株SRI-01隨機(jī)突變庫(kù)

采用96孔板高通量篩選，從2 300株突變文庫(kù)中獲得一株優(yōu)勢(shì)突變株SRM08，進(jìn)行核酸測(cè)序，結(jié)果見圖3。由圖3可知，突變株SRM08的脂肪酶基因核酸序列在原始重組菌SRI-01基礎(chǔ)上突變了兩個(gè)位點(diǎn)，即為SRM08（C510A/T530A）。但是氨基酸位點(diǎn)只突變了一個(gè)，177位的亮氨酸突變?yōu)楣劝滨０?。親水性的谷氨酰胺可能有助于脂肪酶活性的提高。

圖3 突變株SRM08與原始菌SRI-01脂肪酶核酸序列比對(duì)Fig.3 Aligment of nucleotide sequences of lipase from mutant strain SRM08 and original strain SRI-01

2.3 突變菌株SRM08誘導(dǎo)條件的研究

2.3.1 誘導(dǎo)前菌體生物量的確定

誘導(dǎo)前菌體生物量對(duì)突變菌株SRM08脂肪酶活力的影響結(jié)果見圖4。

圖4 誘導(dǎo)前的生物量對(duì)突變菌株SRM08脂肪酶活力的影響Fig.4 Effect of biomass before induction on lipase activity of mutant strain SRM08

由圖4可知，將突變菌株轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)1.50～3.25 h后的菌體進(jìn)行誘導(dǎo)，在對(duì)數(shù)期菌體生物量明顯增加。培養(yǎng)2.5 h，OD600nm值為0.7時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得的突變株脂肪酶相對(duì)活力最高。此時(shí)的菌體生長(zhǎng)迅速，代謝旺盛，有利于脂肪酶重組蛋白的表達(dá)。

2.3.2 誘導(dǎo)劑IPTG濃度和CaCl2濃度的優(yōu)化

以原重組菌株SRI-01的誘導(dǎo)條件（IPTG：0.1mmol/L、鈣離子：3mmol/L）為參考依據(jù)，考察了不同添加濃度的誘導(dǎo)劑IPTG和鈣離子對(duì)突變菌株SRM08脂肪酶活力的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 IPTG（A）與CaCl2（B）的濃度對(duì)突變菌株SRM08脂肪酶活性的影響Fig.5 Effects of IPTG(A)and CaCl2(B)concentration on lipase activity of mutant strain SRM08

由圖5A可知，當(dāng)IPTG添加濃度為0.1 mmol/L時(shí)，酶活力最高，即最佳濃度與原重組菌株相同，繼續(xù)提高IPTG濃度，酶活將顯著下降，這可能是由于高濃度的IPTG對(duì)菌株有一定的毒害作用[25]，采用較低濃度的IPTG可以適當(dāng)?shù)亟档娃D(zhuǎn)錄速率，有利于蛋白的可溶性表達(dá)[26]；同時(shí)，由于鈣離子作為脂肪酶的活性中心[27]，也會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生一定影響。由圖5B可知，通過考察不同濃度鈣離子的添加對(duì)酶活性的影響，隨著鈣離子濃度升高，酶活逐漸提高，當(dāng)CaCl2濃度為4 mmol/L時(shí)，酶活最高，原重組菌株最適的3 mmol/L條件僅為最高酶活的69.1%，這可能是由于突變菌對(duì)鈣離子的結(jié)合能力有所提高。

2.3.3 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

誘導(dǎo)溫度不僅影響菌體的生長(zhǎng)，同樣影響重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白的可溶性[28]。誘導(dǎo)溫度對(duì)突變菌株SRM08脂肪酶活性的影響見圖6。

圖6 誘導(dǎo)溫度對(duì)突變菌株SRM08脂肪酶活力的影響Fig.6 Effect of induced temperature on lipase activity of mutant strain SRM08

由圖6可知，在誘導(dǎo)溫度12～20℃時(shí)，脂肪酶活力保持穩(wěn)定，在25℃的誘導(dǎo)溫度時(shí)，酶活大大提高，隨后酶活又隨著溫度升高逐漸下降，37℃誘導(dǎo)的酶活僅為最高值的28.7%，包涵體逐漸增多。因此，選擇25℃作為突變株重組脂肪酶的最適誘導(dǎo)溫度。

2.4 破碎緩沖液pH對(duì)突變株SRM08脂肪酶活力的影響

圖7 緩沖液pH值對(duì)突變菌株SRM08脂肪酶活性的影響Fig.7 Effect of pH value of buffer on lipase activity of mutant strain SRM08

由于pH對(duì)脂肪酶的穩(wěn)定性有一定的影響，考察破碎過程中緩沖液的pH對(duì)脂肪酶可溶蛋白的影響是十分必要的。由圖7所示，pH 7.0時(shí)脂肪酶相對(duì)酶活最高，在pH 7.0～9.0時(shí)，酶活隨著pH上升逐漸下降，pH 8.0時(shí)保留72.3%的相對(duì)酶活，pH 9.0時(shí)保留61.5%的相對(duì)酶活，在偏堿性環(huán)境下，脂肪酶重組蛋白破壁時(shí)相對(duì)穩(wěn)定；但是在pH6.5時(shí)僅保留25.4%的相對(duì)酶活，說(shuō)明此酶對(duì)酸性條件極為敏感。因此，最適pH值為7.0。

2.5 破碎緩沖液離子濃度對(duì)突變株SRM08脂肪酶活力的影響

考察了不同濃度磷酸鉀緩沖液、磷酸鈉緩沖液和Tris-HCl緩沖液對(duì)重組脂肪酶活性影響，結(jié)果如圖8、圖9所示。

圖8 不同濃度的磷酸鉀緩沖液和磷酸鈉緩沖液對(duì)突變菌株SRM08脂肪酶活力的影響Fig.8 Effects of different concentrations of potassium phosphate and sodium phosphate buffer on lipase activity of mutant strain SRM08

圖9 不同濃度Tris-HCl緩沖液對(duì)突變菌株SRM08脂肪酶活性的影響Fig.9 Effects of different concentrations of Tris-HCl buffer on lipase activity of mutant strain SRM08

由圖8、圖9可知，磷酸鈉緩沖液測(cè)定的脂肪酶活性為最高，磷酸鉀緩沖液和Tris-HCl緩沖液酶活數(shù)值相近。超聲破碎后進(jìn)行離心，離子濃度高的緩沖液中沉淀較多，脂肪酶酶活相對(duì)較低；隨著破碎液離子濃度下降，包涵體沉淀逐漸減少，脂肪酶活性逐漸提高。其中磷酸鈉緩沖液的破碎條件下脂肪酶活性最高為88 508 U/L，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度的磷酸鈉緩沖液破碎效果普遍好于磷酸鉀緩沖液，可能是由于高濃度的鉀離子抑制的酶活性。

3 結(jié)論

MEGAWHOP法隨機(jī)突變相較于傳統(tǒng)的隨機(jī)突變方法，更加簡(jiǎn)單高效。但是基因片段過長(zhǎng)，連接至載體上的效率也更低，本研究成功實(shí)現(xiàn)了將脂肪酶基因（1 845 bp）利用此法進(jìn)行隨機(jī)突變，建立了隨機(jī)突變庫(kù)，并從中獲得了優(yōu)勢(shì)菌株SRM08。

通過對(duì)優(yōu)勢(shì)突變株SRM08進(jìn)行誘導(dǎo)條件優(yōu)化，突變株誘導(dǎo)前的菌體生物量OD600nm值為0.7（培養(yǎng)時(shí)間2.5 h），誘導(dǎo)溫度25℃時(shí)，IPTG的添加量為0.1 mmol/L，CaCl2濃度為4 mmol/L為最優(yōu)誘導(dǎo)條件。采用5 mmol/L、pH 7.0磷酸鈉緩沖液有利于脂肪酶可溶蛋白的釋放。通過對(duì)隨機(jī)突變獲得的優(yōu)勢(shì)突變株SRM08的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終產(chǎn)脂肪酶能力可達(dá)到88 508 U/L。

優(yōu)質(zhì)穩(wěn)定的脂肪酶高效表達(dá)基因工程菌是獲得脂肪酶工業(yè)化生產(chǎn)的重要前提。構(gòu)建脂肪酶基因突變文庫(kù)，提高基因工程菌的脂肪酶活力，為后續(xù)酶拆分反應(yīng)提供高效的底物特異性脂肪酶，更加有利于縮短拆分反應(yīng)時(shí)間，降低反應(yīng)成本，為酶-化學(xué)法拆分（±）MPGM）的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。