孫 悅，夏 蓉，陶匯源，石吉勇，鄒小波*

（1.江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.鎮(zhèn)江恒順生物工程有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

食醋是人們?nèi)粘Ｉ畹囊环N重要調(diào)味品，在中國(guó)傳統(tǒng)食醋釀造中，鎮(zhèn)江香醋是米醋的典型代表之一，因其具有“酸而不澀，香而微甜，色濃味鮮，愈存愈香”的特點(diǎn)，受到國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。鎮(zhèn)江香醋發(fā)酵過(guò)程中主要分為三個(gè)階段：糖化階段、酒精發(fā)酵階段、醋酸發(fā)酵階段[1]。前期研究表明，在固態(tài)發(fā)酵階段，微生物種群相對(duì)穩(wěn)定，且微生物種類和微生物活性在發(fā)酵過(guò)程中呈周期性變化[2]。醋酸桿菌是香醋發(fā)酵階段微生物中重要的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)酸菌屬之一，在食醋生產(chǎn)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。因此，對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中醋酸桿菌的調(diào)控具有重要意義。

近年來(lái)，超聲波技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品微生物領(lǐng)域。超聲波是一種頻率高于20 kHz的能量機(jī)械波，具有方向性好、穿透能力強(qiáng)、振動(dòng)強(qiáng)烈等特點(diǎn)[3]。當(dāng)超聲波穿過(guò)液體時(shí)，這種機(jī)械波產(chǎn)生的高頻振動(dòng)會(huì)導(dǎo)致物料內(nèi)部受到快速劇烈的擠壓膨脹，產(chǎn)生微射流。由超聲產(chǎn)生的微射流會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的通透性，同時(shí)還會(huì)加快細(xì)胞壁及細(xì)胞膜邊界層的傳質(zhì)速率，改變細(xì)胞的生理代謝，從而強(qiáng)化發(fā)酵過(guò)程[4-5]。SINISTERRA J V[6]研究表明，超聲波可以刺激細(xì)胞及酶活，并且可以在細(xì)胞邊界層或者通過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜改變細(xì)胞的代謝、提高物質(zhì)（物料及產(chǎn)物）傳遞。同時(shí)超聲波產(chǎn)生的微射流還可以打散團(tuán)聚的細(xì)胞，提高細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的利用率，增大細(xì)胞的生物量。DAI C等[7-8]對(duì)超聲刺激阿氏假囊酵母（Ecemothecium ashbyii）發(fā)酵產(chǎn)生核黃素進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在最佳處理?xiàng)l件（超聲頻率24 kHz）下，超聲不僅可以促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)，還可以提高核黃素的產(chǎn)量。DAHROUDA B D等[9]用振幅40%，時(shí)間30 s的低強(qiáng)度超聲場(chǎng)處理干酪乳酸桿菌（Lactobacillus caseisubsp.）發(fā)酵液后證實(shí)，低強(qiáng)度超聲可以促進(jìn)乳酸桿菌發(fā)酵，其中L-乳酸產(chǎn)量及生物量均提高了約25%。此外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了超聲強(qiáng)化發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）[10]、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）[4]和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[11-12]的發(fā)酵特性及理化特性研究，均取得了明顯的促進(jìn)效果。然而，有關(guān)香醋發(fā)酵過(guò)程中超聲強(qiáng)化巴氏醋桿菌（Acetobacterpasteurianus）發(fā)酵特性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究以巴氏醋桿菌（A.pasteurianus）為研究對(duì)象，采用超聲波技術(shù)研究超聲波功率、超聲時(shí)間及溫度對(duì)發(fā)酵過(guò)程中巴氏醋酸桿菌的生物量、產(chǎn)酸能力及細(xì)胞通透性的影響，為鎮(zhèn)江香醋發(fā)酵過(guò)程的控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

巴氏醋桿菌（A.pasteurianus）CICC 20041：購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、酵母提取物、NaCl、瓊脂、NaOH、無(wú)水乙醇（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH 6.8左右，121℃滅菌15 min，等溫度降至50℃左右時(shí)加入無(wú)水乙醇3%。

固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂2%。

1.2 儀器與設(shè)備

BS2000S電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司；T6新世紀(jì)型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DSX-280型手提式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；GHP-9050型隔水式培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HYL-C小型組合式搖床：太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KS-120AL超聲波設(shè)備：深圳市科潔超聲科技有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的培養(yǎng)

從4℃冰箱中保藏的試管斜面菌種中挑取少量菌種A.pasteurianusCICC 20041，在無(wú)菌條件下接種于液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)24 h，得到巴氏醋桿菌培養(yǎng)液。然后以1%的接種量接種于盛有200 mL的液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵溫度37℃、搖床轉(zhuǎn)速170 r/min條件下培養(yǎng)24 h，得到的巴氏醋桿菌以備后面的試驗(yàn)。

1.3.2 巴氏醋桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

巴氏醋桿菌在37℃、170 r/min的發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵，以未接種菌體的液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，在生長(zhǎng)至0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、11 h、24 h、32 h時(shí)取發(fā)酵液，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值。繪制巴氏醋桿菌的生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 巴氏醋桿菌的超聲波處理?xiàng)l件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

當(dāng)接種量為1%的醋酸桿菌在200 mL培養(yǎng)基中發(fā)酵至24 h時(shí)，取5 mL的發(fā)酵液進(jìn)行超聲處理，處理后的樣品進(jìn)行微生物菌落總數(shù)計(jì)數(shù)。分別吸取1 mL未經(jīng)處理和經(jīng)過(guò)超聲處理的菌懸液，用無(wú)菌生理鹽水稀釋到適宜梯度，涂布在固體培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃條件下培養(yǎng)24 h，得到經(jīng)過(guò)超聲處理后的菌落數(shù)為N（CFU/mL），未經(jīng)處理的菌懸液的菌落數(shù)為N0（CFU/mL），以生物量增量（%）來(lái)評(píng)價(jià)超聲波對(duì)醋酸桿菌的影響。

采用單因素輪換法，分別選擇超聲時(shí)間（5min、10min、15 min、20 min、25 min）、超聲溫度（25 ℃、40℃、55 ℃）、超聲功率（200 W、400 W、600 W、750 W）對(duì)培養(yǎng)24 h后的發(fā)酵液進(jìn)行處理，測(cè)定生物量增量以確定最適超聲條件。

其中為防止超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)熱效應(yīng)引起的溫度上升，使用冰袋進(jìn)行及時(shí)降溫。

1.3.4 不同生長(zhǎng)期超聲處理對(duì)巴氏醋桿菌產(chǎn)酸能力的影響

將相同濃度的巴氏醋桿菌種子液按接種量1%分別接種到200 mL培養(yǎng)基中，在37℃、170 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間（2 h、5 h、8 h、10 h、20 h、25 h、32 h）分別對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行超聲處理，超聲處理?xiàng)l件選擇單因素試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳參數(shù)，處理后繼續(xù)進(jìn)行搖床發(fā)酵，96 h后測(cè)定醋酸桿菌在不同生長(zhǎng)時(shí)期超聲處理的總酸含量，以未經(jīng)超聲處理發(fā)酵96 h的發(fā)酵液中的總酸含量為對(duì)照?？偹釡y(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定法[13]。

1.3.5 超聲處理對(duì)巴氏醋桿菌細(xì)胞通透性的影響

取3 mL發(fā)酵24 h時(shí)的菌液，稀釋5倍，以5 000 r/min的速率離心5 min，取上清液，以未接種菌種的液體培養(yǎng)基為空白，在超聲溫度為單因素確定的最適溫度條件下，測(cè)定不同超聲時(shí)間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）和不同超聲功率（200 W、400 W、600 W、750 W）前后巴氏醋桿菌細(xì)胞外液核酸、蛋白質(zhì)的變化，判斷超聲處理對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響。

核酸和蛋白質(zhì)提高率的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[14]，分別在波長(zhǎng)260nm和280 nm條件下，測(cè)定菌液的吸光度值。核酸提高率的計(jì)算公式如下：

式中：R1為核酸提高率，%；a表示未超聲處理的菌液在波長(zhǎng)260 nm處的吸光度值；b表示經(jīng)過(guò)超聲處理后的菌液在波長(zhǎng)260 nm處的吸光度值。

蛋白質(zhì)的提高率計(jì)算公式如下：

式中：R2為蛋白質(zhì)提高率，%；c表示未超聲處理的菌液在波長(zhǎng)280 nm處的吸光度值；b表示經(jīng)過(guò)超聲處理后的菌液在波長(zhǎng)280 nm處吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴氏醋桿菌生長(zhǎng)曲線

圖1 巴氏醋桿菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve ofA.pasteurianus

巴氏醋桿菌生長(zhǎng)曲線如圖1所示。由圖1可知，巴氏醋桿菌的生長(zhǎng)遲滯期較短，說(shuō)明巴氏醋桿菌可以很快適應(yīng)新的培養(yǎng)基并快速繁殖生長(zhǎng)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期約為2～15 h，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24h時(shí)，菌株處于穩(wěn)定期，此時(shí)期的菌株個(gè)體形態(tài)及生理指標(biāo)都相對(duì)較為穩(wěn)定。巴氏醋桿菌的生長(zhǎng)曲線符合Logistic模型。

2.2 巴氏醋桿菌的超聲波處理?xiàng)l件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲時(shí)間對(duì)巴氏醋桿菌的影響

在超聲波功率為400 W，超聲溫度為40℃的條件下，超聲時(shí)間對(duì)巴氏醋桿菌生物量的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同超聲時(shí)間對(duì)巴氏醋桿菌生物量增量的影響Fig.2 Effects of different ultrasound time on the biomass increment ofA.pasteurianus

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，巴氏醋桿菌的生物量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)，巴氏醋桿菌的生物量增量最高，為41.80%，說(shuō)明將超聲波作用于巴氏醋桿菌發(fā)酵過(guò)程中，在一定條件下可以提高其活菌數(shù)量。分析原因可能是在發(fā)酵過(guò)程中施加超聲，超聲波產(chǎn)生的高頻振動(dòng)將能量傳入細(xì)胞內(nèi)部，細(xì)胞內(nèi)組織結(jié)構(gòu)受到反復(fù)的收縮和舒張作用而產(chǎn)生“海綿效應(yīng)”，從而可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)傳遞，加速細(xì)胞生理代謝反應(yīng)的進(jìn)行，從而提高細(xì)菌的生物量[15]；當(dāng)超聲時(shí)間為5 min時(shí)，醋酸桿菌生物量增量為-3.47%，與無(wú)超聲作用基本相同（P＞0.05），可能是因?yàn)槌曌饔脮r(shí)間較短，超聲產(chǎn)生的效應(yīng)不明顯。超聲15min和20min的細(xì)胞生物量增量無(wú)顯著性差異（P＞0.05），因此選擇最優(yōu)超聲時(shí)間為15 min。HUANG G等[16]對(duì)超聲如何提高熱帶念珠菌（Candida tropicalis）細(xì)胞膜的通透性及生長(zhǎng)速率進(jìn)行了研究，也發(fā)現(xiàn)短時(shí)間的超聲提高生物量的效果較好，長(zhǎng)時(shí)間的超聲會(huì)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)與其所得結(jié)論一致。

2.2.2 超聲溫度對(duì)巴氏醋桿菌的影響

在超聲波功率為400 W，超聲時(shí)間為15 min的條件下，超聲溫度對(duì)巴氏醋桿菌生物量的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同超聲溫度對(duì)巴氏醋桿菌生物量增量的影響Fig.3 Effects of different ultrasound temperature on the biomass increment ofA.pasteurianus

由圖3可知，隨著超聲溫度的升高，巴氏醋桿菌的生物量增量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。當(dāng)超聲溫度為25℃時(shí)，巴氏醋桿菌的生物量增量為-18.15%；當(dāng)超聲溫度為40℃時(shí)，巴氏醋桿菌的生物量增量為31.37%；但當(dāng)超聲溫度為55℃時(shí)，巴氏醋桿菌的生物量增量?jī)H為-99.88%，說(shuō)明超聲溫度對(duì)醋酸桿菌的生物量具有影響，尤其是較高溫度下的影響更顯著（P＜0.05）。朱瑤迪等[17]研究表明，在高溫下施加超聲會(huì)增強(qiáng)超聲對(duì)醋酸桿菌的致死效果，從而不利于發(fā)酵的進(jìn)行。EVELYN E等[18]研究超聲對(duì)脫脂牛奶和牛肉中嗜冷芽孢桿菌（Bacillus psychrophilus）的致死效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在較高溫度下施加超聲可以增強(qiáng)對(duì)細(xì)菌的致死率。本試驗(yàn)與其研究結(jié)果一致。因此選擇最優(yōu)超聲溫度為40℃。

2.2.3 超聲功率對(duì)巴氏醋桿菌的影響

在超聲時(shí)間為15min，超聲溫度為40℃的條件下，超聲波功率對(duì)巴氏醋桿菌生物量的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同超聲功率對(duì)巴氏醋桿菌生物量增量的影響Fig.4 Effects of different ultrasound power on the biomass increment ofA.pasteurianus

由圖4可知，隨著超聲波功率的增大，巴氏醋桿菌細(xì)胞生物量增量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。其中在較低功率和較高功率條件下，施加超聲對(duì)醋酸桿菌均有輕微抑制作用。分析原因可能是超聲功率太小時(shí)，不能有效夠刺激細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外物質(zhì)傳遞及能量交換[12]，而超聲功率過(guò)大會(huì)導(dǎo)致其空化效應(yīng)顯著，由超聲產(chǎn)生的高頻振動(dòng)使得介質(zhì)中的液體發(fā)生快速膨脹和收縮，在介質(zhì)中產(chǎn)生空泡，超聲產(chǎn)生的破壞應(yīng)力（剪切力）會(huì)使空泡產(chǎn)生瞬間爆破，從而形成強(qiáng)大的動(dòng)能和壓縮能[3，19]，破壞細(xì)胞的完整性。另外高功率超聲還會(huì)使水分子裂解產(chǎn)生少量具有強(qiáng)氧化能力的自由基，破壞細(xì)胞活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，加速細(xì)胞死亡[20]。當(dāng)超聲功率為600W時(shí)，巴氏醋桿菌生物量相比無(wú)超聲作用增加了82.35%，表明合適功率的超聲波對(duì)巴氏醋桿菌具有一定刺激作用。YANG F等[21-22]研究表明，超聲的聲孔效應(yīng)會(huì)使微生物細(xì)胞膜上暫時(shí)產(chǎn)生微小孔洞，從而為基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞及有毒有害物質(zhì)的去除提供通道，提高細(xì)胞膜的滲透性。

2.3 不同生長(zhǎng)期超聲處理對(duì)巴氏醋桿菌產(chǎn)酸能力的影響

分別在巴氏醋桿菌發(fā)酵2 h、5 h、8 h、10 h、20 h、25 h和32h時(shí)，進(jìn)行超聲處理。巴氏醋桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行超聲處理對(duì)其總酸含量的影響結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同生長(zhǎng)時(shí)期超聲處理對(duì)巴氏醋桿菌總酸含量的影響Fig.5 Effects of ultrasound treatment on total acid content of A.pasteurianusat different fermentation periods

由圖5可知，與對(duì)照組總酸含量（21.00 g/L）相比，在巴氏醋桿菌發(fā)酵2 h、10 h、20 h、25 h時(shí)進(jìn)行超聲處理，均會(huì)增加總酸含量，其中在平穩(wěn)期中期（25 h）總酸含量最多為24.50 g/L，提高率為16.70%。這可能是由于巴氏醋桿菌在發(fā)酵對(duì)數(shù)期中期細(xì)胞中酶活較強(qiáng)，導(dǎo)致超聲刺激對(duì)其影響不顯著（P＞0.05）[12]。而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，進(jìn)入平穩(wěn)期后，超聲的微流擾動(dòng)可以將團(tuán)聚的細(xì)胞分散開(kāi)，使得培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得到充分利用，從而加快物質(zhì)的傳遞與合成速率[15]；同時(shí)，超聲會(huì)使酶的活性發(fā)生改變，酶與底物碰撞機(jī)率增大，細(xì)胞的生理代謝速率增強(qiáng)[22-24]，從而促進(jìn)醋酸分子的合成。

2.4 超聲處理對(duì)巴氏醋桿菌細(xì)胞通透性的影響

不同超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)巴氏醋桿菌細(xì)胞通透性的影響結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同超聲時(shí)間（a）和超聲功率（b）對(duì)巴氏醋桿菌細(xì)胞通透性的影響Fig.6 Effects of different ultrasound time(a)and ultrasound power(b)on cell permeability ofA.pasteurianus

由圖6（a）可知，隨著超聲時(shí)間的增加，細(xì)胞外核酸和蛋白質(zhì)的滲出濃度提高率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，且核酸和蛋白質(zhì)的提高率基本相同。當(dāng)超聲時(shí)間為5 min時(shí)，巴氏醋桿菌細(xì)胞外液中核酸與蛋白質(zhì)的提高率最高，分別為4.17%和3.93%，其原因可能是由于在超聲時(shí)間為5 min時(shí)，超聲的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)使得細(xì)胞受到瞬時(shí)的動(dòng)能和壓縮能，造成表面微傷，使細(xì)胞壁局部破裂，從而改變細(xì)胞膜的通透性，加速細(xì)胞內(nèi)外核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的交換速率；當(dāng)超聲時(shí)間為10 min時(shí)，細(xì)胞通透性逐漸恢復(fù)到原來(lái)的水平，這可能是由于當(dāng)超聲條件適宜時(shí)，超聲造成的細(xì)胞表面?zhèn)谳^小，能夠被醋酸桿菌自身修復(fù)，從而抑制核酸和蛋白質(zhì)的滲出[14]；但隨著超聲時(shí)間的再次增大至15～25 min時(shí)，胞外核酸和蛋白質(zhì)的滲出濃度提高率再次升高，這可能是因?yàn)槌晫?duì)細(xì)胞膜的通透性影響逐漸超過(guò)了菌體的承受能力[14]。因此選擇最優(yōu)超聲時(shí)間為15 min。

由圖6（b）還知，當(dāng)超聲功率≤600 W時(shí)，核酸和蛋白質(zhì)提高率較小，表明超聲功率較小時(shí)對(duì)細(xì)胞的通透性影響不大；然而隨著超聲功率增大至750 W時(shí)，核酸和蛋白質(zhì)的提高率分別升高至24.6%和28.3%，分析原因可能是當(dāng)施加較大超聲功率時(shí)，巴氏醋桿菌細(xì)胞膜的通透性受到顯著影響（P＜0.05），細(xì)胞開(kāi)始崩解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)大量滲出。因此，考慮細(xì)胞通透性和生物量，選擇600W為最優(yōu)超聲功率。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了超聲波對(duì)巴氏醋桿菌生物量、代謝產(chǎn)物及細(xì)胞通透性的影響，結(jié)果表明，最優(yōu)超聲條件為超聲時(shí)間15 min、超聲溫度40℃、超聲功率600 W。在此最優(yōu)超聲條件下，與無(wú)超聲處理相比，巴氏醋桿菌生物量增加82.35%。通過(guò)對(duì)巴氏醋桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行超聲處理，得出在穩(wěn)定期中期（25 h）進(jìn)行超聲處理時(shí)，對(duì)巴氏醋桿菌的總酸含量影響顯著（P＜0.05），總酸含量提高了16.7%，表明在合適的生長(zhǎng)期進(jìn)行超聲處理有利于發(fā)酵的進(jìn)行。超聲處理對(duì)巴氏醋桿菌細(xì)胞外液核酸及蛋白質(zhì)滲透性的影響結(jié)果顯示，核酸和蛋白質(zhì)的提高率均隨著超聲時(shí)間和超聲功率的增大呈先降低后升高的趨勢(shì)。將超聲波處理技術(shù)應(yīng)用于巴氏醋桿菌發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)特性及代謝產(chǎn)物的研究，對(duì)調(diào)控香醋發(fā)酵、提高產(chǎn)品品質(zhì)具有一定理論指導(dǎo)和實(shí)踐價(jià)值。