郭旭凱，楊 玲*，劉 聰，王 琪，段 冰，郭 睿，邵 強(qiáng)，柳青山

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高粱研究所，山西 晉中 030600；2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

山西老陳醋是我國的四大名醋之一，具有醇厚濃郁的香味和多種保健功效，因此廣受消費(fèi)者的喜愛[1]。

山西老陳醋因其有獨(dú)特的釀造工藝和特定的地理氣候而形成了獨(dú)一無二的風(fēng)味。在山西老陳醋的釀造過程中，各種微生物類群相互作用共同決定了老陳醋的產(chǎn)量和品質(zhì)，其中乳酸菌和醋酸菌是不可或缺的類群[2]。趙國忠等[3]從天津獨(dú)流老醋中分離到的優(yōu)良乳酸菌是植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。王夢穎等[4]采用16S rDNA宏基因組的測序手段對山西老陳醋發(fā)酵過程中的菌群微生態(tài)進(jìn)行了分析，并分離出19株乳酸菌，包括6株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、7株干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）和6株瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）。于迪等[5]從山西老陳醋發(fā)酵過程的酒化階段分出的10株乳酸菌和醋化階段分出的25株乳酸菌進(jìn)行產(chǎn)酸定量試驗(yàn)，最終篩選出產(chǎn)酸量高、耐受性好的2株菌分別是發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）和干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。呂艷歌等[1]從山西老陳醋醋醅中連續(xù)采樣分離的產(chǎn)酸菌群主要是醋酸桿菌、乳酸桿菌和芽孢桿菌，優(yōu)勢種群為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）。弓曉艷等[6]從山西老陳醋醋醅中連續(xù)采樣篩到了4株產(chǎn)酸功能菌，分別是植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）。胡會萍[7]對山西老陳醋不同發(fā)酵階段醋醅中的醋酸菌進(jìn)行了遺傳學(xué)分類鑒定和生產(chǎn)性能的研究，得到了60株醋酸菌，分別歸為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）、漢氏醋桿菌（Acetobacter hansenii）、醋化醋桿菌（Acetobacter aceti）、惡臭醋桿菌（Acetobacter rancens）和液化醋桿菌（Acetobacter liquefaciens）。國內(nèi)關(guān)于山西老陳醋的研究已有許多，然而在醋醅中仍然存在著大量的未被開發(fā)利用的乳酸菌和醋酸菌。因此，從山西老陳醋的醋醅中分離有益乳酸菌和醋酸菌，可以為山西老陳醋的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

已有研究表明，除菌種外，影響山西老陳醋風(fēng)味的另一個主要原因是釀造原料。在釀造原料中，高粱是主要的，高粱中含有單寧。植物單寧對多種微生物的生長具有抑制作用[8-12]。而在山西老陳醋的釀造過程中，高粱單寧對主要微生物的生長具有什么樣的影響尚不清楚，目前也沒有相關(guān)的研究報(bào)道。因此，本研究從山西老陳醋釀造過程中分離鑒定乳酸菌和醋酸菌，并研究高粱單寧對它們生長的影響，可以為選育具有合理單寧含量的高粱品種提供理論依據(jù)，從而進(jìn)一步提高山西老陳醋的原料利用率、產(chǎn)量和品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

采集山西老陳醋酒精發(fā)酵階段的酒醅，從第1天開始，每3d采集一次，共8個樣品；采集醋酸發(fā)酵階段第1天、第4天和第8天的醋醅，共3個樣品。每個樣品3個平行。

體積分?jǐn)?shù)為30%和80%乙醇洗脫單寧的制備：稱取高粱外種皮粉末，以體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液為提取溶劑，料液比1∶20（g∶mL），超聲波輔助提取60 min（超聲功率100 W，頻率40 kHz），提取溫度為50℃。提取后的溶液經(jīng)過濾、減壓蒸餾獲得高粱單寧濃縮液，后經(jīng)過大孔吸附樹脂AB-8進(jìn)行純化，分別用超純水、體積分?jǐn)?shù)為30%、80%乙醇溶液洗脫，并對提取液分別進(jìn)行減壓抽真空濃縮、后放置于真空干燥器常溫干燥后得相應(yīng)固體粉末。

1.1.2 試劑

Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、100 bp DNA Ladder、λDNA/Hind III、6×DNA Loading Buffer、瓊脂糖、制霉素：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

乳酸菌分離培養(yǎng)基[13]：酵母膏10 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，葡萄糖10 g，番茄汁100 mL，吐溫80 0.5 mL，CaCO32g，瓊脂15g，胡蘿卜40g，溴甲酚綠0.1mL，自來水900mL，pH6.5。121℃滅菌15 min，倒平板前加入過濾除菌的制霉素，使其終濃度為50 μg/mL。

乳酸菌液體培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，吐溫-800.5mL，瓊脂15g，胡蘿卜40g，溴甲酚綠0.1mL，自來水900mL，pH6.5。121℃滅菌15 min。

醋酸菌分離培養(yǎng)基[13]：葡萄糖100g，酵母膏10 g，CaCO320g，瓊脂20g，自來水1000mL，pH6.8。121℃滅菌15min，倒平板前加入過濾除菌的制霉素（終濃度為50 μg/mL）和過濾除菌的無水乙醇（終濃度為1%）。

醋酸菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖100g，酵母膏10g，瓊脂20g，自來水1 000 mL，pH 6.8。121℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、XM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、GZX-9076MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱、CS601超級恒溫水浴：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HC-2518高速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Centrifuge 5430R小型臺式高速冷凍離心機(jī)、Innova U360超低溫冰箱：德國艾本德公司；T100 Thermal Cycler PCR儀、Gel Doc 2000 UV凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠；CS601超級恒溫水?。荷虾２┭笇?shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同發(fā)酵階段樣品中乳酸菌的分離

無菌條件下稱取樣品10 g，加入盛有90 mL無菌水的裝有適量玻璃珠的三角瓶中，200 r/min搖床振蕩1 h，制成10-1稀釋度菌懸液。吸取10-1稀釋度菌懸液1 mL到9 mL無菌水的試管中，混合均勻，制成10-2稀釋度懸液。依此類推，制成10-5～10-8稀釋度菌懸液。分別吸取10-5～10-8稀釋度菌懸液0.2 mL，涂布于乳酸菌平板，每個稀釋度3個平行，對應(yīng)品溫培養(yǎng)12～72 h后挑取單菌進(jìn)一步純化。

1.3.2 不同發(fā)酵階段樣品中乳酸菌的鑒定

乳酸菌的富集培養(yǎng)：將每株乳酸菌分別接種于乳酸菌液體培養(yǎng)基中，25 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，12 000 r/min離心10 min收集菌體沉淀。用無菌水反復(fù)洗滌沉淀3次，用于提取基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）。

乳酸菌基因組DNA的提取、檢測：利用試劑盒來提取每株乳酸菌的總基因組DNA，-20℃保存。取5 μL基因組DNA，并加入1 μL 6×DNA Loading Buffer，混勻后用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

乳酸菌16S rDNA V3-V4序列的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增：擴(kuò)增引物為338 F：5'-ACT CCTACGGGAGGCAGCAG-3'，806R：5'-GACTACHVGGG TWTCTAAT-3'。

PCR反應(yīng)體系 （50 μL）：2×TaqDNA MasterMix 25 μL；338F（10 μmol/L）5 μL；806R（10 μmol/L）5 μL；基因組DNA模板1 μL；ddH2O補(bǔ)至50 μL。所有試劑添加完畢后，輕輕混勻。陰性對照不加模板。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃、5 min；變性94 ℃、30 s；退火55℃、30 s；延伸72 ℃、90 s；35個循環(huán)后，72℃保溫10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)檢測。

乳酸菌16S rDNA V3-V4序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)檢測。

乳酸菌16SrDNAV3-V4序列的測定：將回收產(chǎn)物送華大基因研究中心測序。將測序結(jié)果用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列來比對，找出最相似的序列。

1.3.3 高粱單寧對不同發(fā)酵階段樣品中乳酸菌生長的影響

體積分?jǐn)?shù)為30%、80%乙醇洗脫的單寧溶液的配制：稱取一定量的體積分?jǐn)?shù)為30%、80%乙醇洗脫的高粱單寧，溶于少量無水乙醇中，再加入一定量的蒸餾水，使單寧終含量分別為6.0%、4.0%、3.0%、2.0%、1.5%、1.0%、0.5%。過濾除菌備用。

乳酸菌菌懸液的制備：將試管純菌株接種到50 mL乳酸菌液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)3～5d。培養(yǎng)結(jié)束后，在無菌條件下轉(zhuǎn)入離心管中，8000r/min離心10min。取菌體沉淀在無菌條件下用無菌水洗滌3次，用無菌水制備成10-5～10-8的菌懸液。

單寧對乳酸菌生長的影響：分別向滅菌后約50℃的乳酸菌培養(yǎng)基中加入200 μL不同濃度的單寧，充分混勻倒平板。將每株乳酸菌的10-5～10-8菌懸液分別均勻涂布于上述平板，每個稀釋度3個平行，每個單寧濃度3個平行。在28℃條件下培養(yǎng)2～3 d，培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以無單寧的平板為對照。

1.3.4 不同發(fā)酵階段樣品中醋酸菌的分離及鑒定

方法同1.3.1、1.3.2，培養(yǎng)基用醋酸菌培養(yǎng)基。

1.3.5 高粱單寧對不同發(fā)酵階段樣品中醋酸菌生長的影響

方法同1.3.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵階段的樣品中乳酸菌的分離、鑒定

從不同發(fā)酵階段的酒醅和醋醅樣品中共分離到乳酸菌36株，編號為L1～L36，其形態(tài)特征見表1。36株乳酸菌通過前期的形態(tài)觀察、生理生化特性結(jié)合16S rDNA序列測定分別歸為以下幾類：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），發(fā)酵乳酸桿菌（Lactobacillus fermentium），干酪乳酸桿菌（Lactobacillus casei），腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），類食品乳桿菌（Lactobacillus paralimentarius）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

表1 不同溫度樣品中乳酸菌的菌落特征Table 1 Colony characteristics of lactic acid bacteria in samples at different temperature

2.2 高粱單寧對不同發(fā)酵階段的樣品中乳酸菌生長的影響

2.2.1 體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇洗脫的單寧對乳酸菌生長的影響

單寧含量在0～6.0%的范圍內(nèi)對36株乳酸菌生長的影響結(jié)果見表2。由表2可知，隨著單寧含量的升高，不同乳酸菌的生長情況不同。在單寧含量為0～1.5%范圍內(nèi)，所有乳酸菌的生長均被促進(jìn)。在單寧含量為2.0%時(shí)，干酪乳桿菌（L1、L4、L7、L9、L24）生長受到非常明顯的促進(jìn)；腸膜明串珠菌（L2、L3、L5、L8、L11、L12）、短乳桿菌（L15、L16、L18、L19、L20）、植物乳桿菌（L17）和發(fā)酵乳桿菌（L21、L22、L23、L25、L27～L30、L32、L36）的生長受到不明顯的促進(jìn)；類植物乳桿菌（L6、L10、L13、L14、L26）、植物乳桿菌（L31、L33～L35）的生長受到抑制。隨著單寧含量的繼續(xù)增加，所有乳酸菌的生長均開始被抑制，單寧含量越大抑制作用越強(qiáng)。所有菌株在單寧含量為6.0%時(shí)都不能生長。

表2 體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇洗脫的單寧對乳酸菌菌落數(shù)的影響Table 2 Effect of tannin eluted by volume fraction 80%ethanol on the number of colony of lactic acid bacteria CFU/mL

續(xù)表

2.2.2 體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇洗脫的單寧對乳酸菌生長的影響

單寧含量在0～6.0%范圍內(nèi)對36株乳酸菌生長的影響結(jié)果見表3。由表3可知，隨著單寧含量的升高，不同乳酸菌的生長情況不同。在單寧含量為0～1.5%范圍內(nèi)，所有乳酸菌的生長均被促進(jìn)。在單寧含量為2.0%時(shí)，干酪乳桿菌（L1、L9、L24）的生長被明顯地促進(jìn)；干酪乳桿菌（L4）、腸膜明串珠菌（L11、L12）、植物乳桿菌（L17、L34）、短乳桿菌（L20）和發(fā)酵乳桿菌（L21、L22、L25、L27、L32）的生長稍有促進(jìn)；腸膜明串珠菌（L2、L3、L8）、干酪乳桿菌（L7）、短乳桿菌（L15、L16、L18、L19）和發(fā)酵乳桿菌（L23、L28～L30、L36）的生長幾乎不受影響；腸膜明串珠菌（L5）、類植物乳桿菌（L6、L10、L13、L14、L26）和植物乳桿菌（L31、L33、L35）的生長被抑制。但是隨著單寧含量的繼續(xù)增加，所有菌株的生長都開始受到抑制，單寧含量越高抑制作用越強(qiáng)。所有菌株在單寧含量為6.0%時(shí)都不生長。

綜上所述，體積分?jǐn)?shù)為80%和30%乙醇洗脫的單寧在含量為0～1.5%時(shí)，所有菌的生長均被促進(jìn)；在單寧含量為2.0%時(shí)，27株菌的生長受到不同程度的促進(jìn)，9株菌的生長受到抑制；當(dāng)單寧含量為3.0%～6.0%時(shí)，所有乳酸菌的生長均被抑制，直到單寧含量為6.0%時(shí)菌株徹底不生長。

表3 體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇洗脫的單寧對乳酸菌菌落數(shù)的影響Table 3 Effect of tannin eluted by volume fraction 30%ethanol on the number of colony of lactic acid bacteria CFU/mL

2.3 不同發(fā)酵階段的樣品中醋酸菌的分離、鑒定

從不同發(fā)酵階段的酒醅和醋醅樣品中共分離到醋酸菌25株，編號為V1～V25，其形態(tài)特征見表4。25株醋酸菌通過前期的形態(tài)觀察、生理生化特性結(jié)合16S rDNA測序分別歸為以下幾類：巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）、醋化醋桿菌（Acetobacter aceti），液化醋桿菌（Acetobacter liquefaciens）和惡臭醋酸桿菌（Acetobacter rancens）。

表4 不同溫度樣品中醋酸菌的菌落特征Table 4 Colony characteristics of acetic acid bacteria in samples at different temperature

2.4 高粱單寧對不同發(fā)酵階段的樣品中醋酸菌生長的影響

2.4.1 體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇洗脫的高粱單寧對醋酸菌生長的影響

在單寧含量為0～6.0%范圍內(nèi)對25株醋酸菌生長的影響結(jié)果見表5。由表5可知，不同含量的單寧對不同醋酸菌生長的影響不同。在單寧含量在0～1.5%時(shí)，絕大部分醋酸菌的生長呈現(xiàn)促進(jìn)的規(guī)律（醋化醋桿菌V2、V3、V8、V18除外）。當(dāng)單寧含量為2.0%時(shí)，液化醋桿菌（V4、V7、V9和V15）的生長受到明顯的促進(jìn)；巴氏醋桿菌（V5、V14、V16、V19、V23）、液化醋桿菌（V12）和醋化醋桿菌（V11）的生長稍被促進(jìn)；醋化醋桿菌（V1～V3、V8、V18、V24和V25）和惡臭醋桿菌（V6、V10、V13、V17）的生長被抑制。當(dāng)單寧含量繼續(xù)增大時(shí)，所有菌的生長都開始表現(xiàn)出抑制，且單寧含量越高抑制作用越強(qiáng)。單寧含量為6.0%時(shí)所有菌均不生長。

表5 體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇洗脫的單寧對醋酸菌菌落數(shù)的影響Table 5 Effect of tannin eluted by volume fraction 80%ethanol on the number of colony of acetic acid bacteriaCFU/mL

2.4.2 體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇洗脫的高粱單寧對醋酸菌生長的影響

單寧含量在0～6.0%的范圍內(nèi)對25株醋酸菌生長的影響結(jié)果見表6。由表6可知，隨著單寧含量的升高，醋酸菌的生長受到不同程度的影響。在單寧含量在0～1.5%的過程中，絕大部分菌株的生長均表現(xiàn)出促進(jìn)的趨勢（醋化醋桿菌V2、V3、V8、V18除外）。當(dāng)單寧含量為2.0%時(shí)，液化醋桿菌（V7、V9）被明顯地促進(jìn)；液化醋桿菌（V12）、醋化醋桿菌（V11）和巴氏醋桿菌（V19、V20、V22、V23）被輕微地促進(jìn)生長；醋化醋桿菌（V1～V3、V8、V18、V24、V25）、液化醋桿菌（V4、V15）、巴氏醋桿菌（V5、V14、V16、V21）和惡臭醋酸桿菌（V6、V10、V13、V17）被抑制。隨著單寧含量的增加，所有菌株的生長都開始被抑制，且單寧含量越高抑制作用越強(qiáng)。單寧含量為6.0%時(shí)所有菌不生長。

綜上所述，體積分?jǐn)?shù)為80%和30%乙醇洗脫的單寧含量在0～1.5%內(nèi)，所有醋酸菌的生長均被促進(jìn)；體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇洗脫的單寧含量為2.0%時(shí)，14株菌的生長被不同程度地促進(jìn)，11株菌的生長受到抑制；體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇洗脫的單寧含量為2.0%時(shí)，8株菌的生長被不同程度地促進(jìn)，17株菌的生長被抑制；而當(dāng)單寧含量為3%～6%時(shí)，所有菌的生長均被抑制，直到單寧含量為6.0%時(shí)菌株徹底不生長。

表6 體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇洗脫的單寧對醋酸菌菌落數(shù)的影響Table 6 Effect of tannin eluted by volume fraction 30%ethanol on the growth of acetic acid bacteria CFU/mL

2.5 討論

本研究從山西老陳醋酒醅和醋醅中分離到的乳酸菌和醋酸菌與其他文獻(xiàn)中的有所區(qū)別，這可能與釀醋的大曲和原料有關(guān)，不同地域環(huán)境中的微生物類群不同，因此分自不同廠家的樣品中的微生物種類也有所差異。

乳酸菌和醋酸菌是食醋釀造的主要微生物。而山西老陳醋釀造主要原料高粱中的單寧對乳酸菌和醋酸菌生長的影響必然會影響整個釀造過程和醋的品質(zhì)。目前，研究者們已發(fā)現(xiàn)，單寧能促進(jìn)部分乳酸菌等的生長。田延楚等[14]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵果蔬汁過程中有些菌對單寧酸的抑制不敏感。林款等[15]研究發(fā)現(xiàn)，添加2 g/L的柿單寧能有效地促進(jìn)腸道有益菌（乳桿菌和雙歧桿菌）的增殖，抑制有害菌（腸球菌、大腸桿菌、梭菌和擬桿菌）的增殖。侯海鋒等[16]發(fā)現(xiàn)，添加了0.1%和0.15%水解單寧酸的蛋雞腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量提高，同時(shí)大腸桿菌數(shù)量顯著降低。李大彪等[17]的研究表明，飼糧單寧添加量達(dá)6%時(shí)抑制瘤胃固相纖維降解菌的增殖。楊德蓮等[18]發(fā)現(xiàn)在奶牛瘤胃體外發(fā)酵液中添加葡萄籽原花青素能顯著影響瘤胃的微生物區(qū)系。目前，普遍認(rèn)為細(xì)菌抗單寧的主要機(jī)制是與生物大分子的絡(luò)合反應(yīng)和金屬離子的螯合作用。但是，如果細(xì)菌中的酶并不依賴金屬離子，那么單寧與金屬離子螯合就不會影響細(xì)菌的生長。如嬰兒雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌就不會被單寧所抑制，乳酸菌不需要鐵離子是因?yàn)槿樗峋邢龠扳挵匪氐拿溉〈撕需F離子的核苷酸還原酶[19]。以上研究主要集中在單寧對體內(nèi)乳酸菌的影響，對于高粱單寧在山西老陳醋釀造過程中的的聯(lián)系與區(qū)別有待進(jìn)一步進(jìn)行研究。

3 結(jié)論

本研究從山西老陳醋發(fā)酵過程中共分離了36株乳酸菌和25株醋酸菌。36株乳酸菌分別為植物乳桿菌（L.plantarum），發(fā)酵乳酸桿菌（L.fermentium），干酪乳酸桿菌（L.casei），腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），類食品乳桿菌（L.paralimentarius）和短乳桿菌（L.brevis）。

通過對分離得到的菌株進(jìn)行含一定濃度高粱單寧培養(yǎng)基的生長試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同洗脫梯度所獲得的高粱單寧對乳酸菌和醋酸菌的影響不大，主要影響因子是其濃度含量。當(dāng)高粱單寧含量在0～1.5%時(shí)，所有乳酸菌和大部分醋酸菌的生長均被促進(jìn)；當(dāng)單寧含量為2.0%時(shí)，對不同菌的生長影響不同（有一些菌株生長被促進(jìn)，而另一些菌株生長被抑制）；而當(dāng)單寧含量為3.0%～6.0%時(shí)，所有乳酸菌和醋酸菌的生長均被抑制，且單寧含量越高抑制作用越強(qiáng)；直到單寧含量為6.0%時(shí)菌株徹底不生長。