安貿(mào)麟， 范 澤， 王慶奎， 孫金輝， 徐大為， 郭永軍， 程鎮(zhèn)燕

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院/天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)試驗(yàn)室，天津西青 300384)

點(diǎn)帶石斑魚(Epinepheluscoioiaes)蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低，不僅包含人體多種代謝所必需的氨基酸，而且富含多種無機(jī)鹽和鐵、鈣、磷這些微量元素以及各種維生素。近年來，石斑魚的養(yǎng)殖已經(jīng)成為我國(guó)東南沿海，以及臺(tái)灣東南部重要的海水養(yǎng)殖的水產(chǎn)品之一。但隨養(yǎng)殖規(guī)模的日益擴(kuò)大，對(duì)魚粉的需求量也不斷增大，而全球魚粉的年產(chǎn)量卻日趨下降，其價(jià)格一直處在高位，使飼料成本居高不下[1]。因此，尋找到節(jié)約飼料魚粉用量的適宜途徑成為點(diǎn)帶石斑魚配合飼料開發(fā)的研究熱點(diǎn)及難點(diǎn)。

目前，節(jié)約飼料魚粉用量的主要途徑均是在尋找適宜的替代蛋白源及利用脂肪或糖類對(duì)蛋白的節(jié)約作用等基礎(chǔ)上進(jìn)行思考與探索，如在翹嘴鲌(Culteralburnus)[2]、齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[3]和鯉(Cyprinuscarpio)[4-6]等均有這些方面工作的報(bào)道。開發(fā)植物蛋白源(如豆粕[2-3]、桑葉發(fā)酵蛋白[7]、玉米蛋白[8]等優(yōu)質(zhì)植物蛋白源)替代魚粉的研究則是此類研究中較為活躍的部分，而其中集蛋白含量較高、數(shù)量體積龐大且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)勢(shì)于一身的豆粕則被認(rèn)為是代替魚粉的第一選擇。但由于豆粕其本身含有例如胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素等抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響了動(dòng)物腸道的微生態(tài)環(huán)境，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收受到妨礙，再加上適口性較差，致使豆粕的使用在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中受到限制[9]。據(jù)報(bào)道，飼料中大豆分離蛋白替代40%的魚粉時(shí)，虹鱒的生長(zhǎng)及飼料轉(zhuǎn)化率達(dá)到最佳[10]；豆粕替代16%的魚粉時(shí)牙鲆生長(zhǎng)性能為適佳[11]。因此，尋找到在特定漁用飼料中豆粕替代魚粉的適宜比例則成為此類研究的重點(diǎn)。目前，尚未見到有關(guān)植物蛋白質(zhì)原料替代魚粉在點(diǎn)帶石斑魚實(shí)用飼料中效果的研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過研究豆粕替代魚粉對(duì)點(diǎn)帶石斑魚生長(zhǎng)性能、消化能力及抗氧化能力的影響，評(píng)價(jià)豆粕替代魚粉在點(diǎn)帶石斑魚實(shí)用飼料中的效果，旨在為優(yōu)化點(diǎn)帶石斑魚人工配合飼料及合理利用大豆蛋白源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

配制6種蛋白質(zhì)含量為48%、脂肪含量為12%、能量為19 MJ/kg的等氮等能飼料，對(duì)照組D0含60%蛋白質(zhì)的魚粉，試驗(yàn)組D1～D5組分別用豆粕代替10%、20%、30%、40%、50%的魚粉蛋白，試驗(yàn)原料預(yù)混料和魚油除外，用電動(dòng)粉碎機(jī)粉碎，過60目網(wǎng)篩，經(jīng)購(gòu)自章丘市華祥顆粒機(jī)械有限公司的“華祥”牌SKJ-120型平模飼料顆粒機(jī)制成直徑為2 mm的顆粒飼料，室溫下風(fēng)干，裝入自封袋，-20 ℃保存?zhèn)溆?，飼料配方和化學(xué)組成見表1。

1.2 試驗(yàn)魚及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)魚為天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司提供的同一批魚種，試驗(yàn)前先用基礎(chǔ)飼料馴化7 d，后選取體質(zhì)健壯、規(guī)格一致[平均體質(zhì)量(84±2.5)g/尾]的點(diǎn)帶石斑魚，放入藍(lán)色養(yǎng)殖箱(80 cm×40 cm×42 cm)中，每箱放養(yǎng)40尾。飼養(yǎng)試驗(yàn)進(jìn)行10周，試驗(yàn)期間每天飽食投喂2次(09：00和15：30)，每天早上清除箱內(nèi)糞便，并換水，每天換水量為總水量的 1/3。養(yǎng)殖試驗(yàn)期間水體溫度為(26±1) ℃，溶解氧濃度為 8.0～10.0 mg/L，pH值為7.5～7.7。

表1 魚飼料組成和營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

注：a.1 kg預(yù)混料組成如下：復(fù)合維生素：維生素B121.7 g、維生素B26.8 g、泛酸鈣 16.9 g、煙酰胺 25.4 g、維生素B61.7 g、葉酸 0.5 g、肌醇67.7 g、包膜維生素C 3.4 g、氯化膽堿169.3 g、維生素K 1.4 g、維生素E 3.4 g、維生素A 0.7 g、生物素0.17 g。復(fù)合礦物質(zhì)：乳酸鈣 221.5 g、K2PO4161.9 g、CaHPO4·2H2O 91.4 g、MgSO4·7H2O 89.4g、Na2HPO4·2H2O 59.1g、檸檬酸鐵 20.1 g、ZnSO4·7H2O 2 g、CoCl2·6H2O 0.7 g、MnSO4·H2O 0.5 g、KI 0.1 g、CuSO4·5H2O 54.2 g、Na2O3Se 0.03g。b.1 kg混合氨基酸組成如下：異亮氨酸 82.3g、亮氨酸 0.25 g、賴氨酸 0.5 g、苯丙氨酸 0.04 g、蘇氨酸 132.9 g、纈氨酸 126.6 g、蛋氨酸 158.2 g。

1.3 樣本采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)魚禁食24 h，從每個(gè)養(yǎng)殖箱中隨機(jī)取15尾魚，測(cè)定魚體質(zhì)量、體長(zhǎng)和全長(zhǎng)，采取尾部靜脈抽血方法，每2尾魚的血液為1個(gè)樣本，注入2 mL的離心管中，在 4 ℃ 下3 500 r/min離心30 min，取上層血清備用，后于冰盤上解剖，取肝胰臟、前腸、中腸及后腸，迅速轉(zhuǎn)入-80 ℃低溫冰箱內(nèi)保存，以用于抗氧化酶活力及消化酶活力的測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算 于試驗(yàn)結(jié)束后饑餓24 h稱量魚體質(zhì)量計(jì)算增質(zhì)量率、飼料效率、成活率等：

體增質(zhì)量(WG)=(末均質(zhì)量-初均質(zhì)量)/初均質(zhì)量×100%；特定生長(zhǎng)率(SGR)=[ln(末均質(zhì)量)-ln(初均質(zhì)量)]/天數(shù)×100%；

飼料轉(zhuǎn)化效率(FCR)=飼料干質(zhì)量/增質(zhì)量×100%；

蛋白質(zhì)效率(PER)=增質(zhì)量/蛋白質(zhì)投喂量×100%；

肥滿度(CF)=體質(zhì)量/體長(zhǎng)×100%。

1.3.2 粗酶液的制備 肝胰臟、前腸、中腸及后腸在冰生理鹽水中漂洗，除去血液，用濾紙拭干，用移液管移入9倍于組織塊質(zhì)量的預(yù)冷勻漿介質(zhì)(0.85%生理鹽水)，在勻漿器中進(jìn)行勻漿，在4 ℃下4 500 r/min離心15 min，取上層清液備用。

1.3.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 消化酶活力檢測(cè)均采用商業(yè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，每個(gè)樣品每種酶活力均重復(fù)測(cè)定3次；蛋白酶活力采用福林酚法測(cè)定；脂肪酶活力的測(cè)定采用比濁法；淀粉酶采用碘——淀粉比色法進(jìn)行測(cè)定。采用商業(yè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)對(duì)血清及組織中還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和過氧化氫酶(CAT)活力及總抗氧化能力(T-AOC)進(jìn)行測(cè)定。其中GSH含量、SOD活力及T-AOC采用Thermofisher-4MK2型微孔讀板機(jī)測(cè)定，其余指標(biāo)采用UVmini-1240型紫外分光光度計(jì)測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均用Excel 2007及SPSS 19進(jìn)行分析處理。利用Excel軟件制作各指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出各樣品中對(duì)應(yīng)指標(biāo)的活性含量。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，則進(jìn)行Duncan’s法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆粕替代魚粉對(duì)點(diǎn)帶石斑魚生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，隨著替代水平的提高，平均末體質(zhì)量、增質(zhì)量率、特定生長(zhǎng)率、蛋白質(zhì)效率呈現(xiàn)明顯的先上升后下降的趨勢(shì)(P<0.05)，其中，平均末體質(zhì)量在10%～20%替代組中差異不顯著，但均顯著高于其他處理組；20%替代組的增質(zhì)量率、特定生長(zhǎng)率、蛋白質(zhì)效率均顯著高于其他處理組(P<0.05)，其余處理組之間差異不顯著。飼料系數(shù)隨著替代水平的提高呈明顯先下降后上升的趨勢(shì)(P<0.05)，其中飼料系數(shù)在10%～20%替代組中差異不顯著(P>0.05)，但顯著低于其他處理組(P<0.05)。肥滿度隨替代水平提高顯著上升(P<0.05)，其中50%替代組與30%、40%替代組無顯著差異，但顯著高于其他處理組(P<0.05)。

表2 飼料中豆粕替代魚粉比例對(duì)點(diǎn)帶石斑魚生長(zhǎng)性能的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示顯示顯著差異(P<0.05)。下表同。

2.2 豆粕替代魚粉對(duì)石斑魚腸道消化酶活性影響

2.2.1 豆粕替代魚粉對(duì)石斑魚腸道蛋白酶活性的影響 由表3可知，前腸蛋白酶活性隨著替代水平提高，先下降后升高，其中對(duì)照組D0(0%)與10%、40%替代組無顯著差異，但顯著高于其他對(duì)照組(P<0.05)。在中腸和后腸中蛋白酶活性隨豆粕替代水平提高先升高后降低，其中中腸蛋白酶活性在40%替代組中顯著高于對(duì)照組和10%替代組(P<0.05)，但與其他處理組無顯著差異；在后腸中40%替代組蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組和30%替代組(P<0.05)，但與其他對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。

表3 豆粕替代魚粉對(duì)點(diǎn)帶石斑魚腸道蛋白酶活性

2.2.2 豆粕替代魚粉對(duì)石斑魚腸道淀粉酶活性的影響 由表4可知，投喂不同豆粕替代水平的飼料后，各組織中淀粉酶活性均值有一定波動(dòng)。在前腸中20%組淀粉酶活性最高，顯著高于對(duì)照組和30%替代組(P<0.05)，與其他各組之間差異不顯著。在中腸中40%與50%替代組無顯著差異，但顯著低于其他處理組(P<0.05)。在后腸中50%替代組淀粉酶活性與10%替代組無顯著差異，但明顯高于其他處理組。

2.2.3 豆粕替代魚粉對(duì)石斑魚腸道脂肪酶活性的影響 由表5可知，投喂不同豆粕替代水平飼料后，腸道中脂肪酶活性先升高后降低。在前腸、中腸、后腸中20%替代組明顯高于其他處理組(P<0.05)。

2.3 豆粕替代魚粉對(duì)石斑魚抗氧化指標(biāo)影響

由表6可知，隨著替代水平的提高，血清超氧化物歧化酶(SOD) 活性顯著降低， 最高值出現(xiàn)在對(duì)照組， 顯著高于50%替代組(P<0.05)，與其他處理組之間差異不顯著；在肝臟中D2(20%)組SOD活性最高且與其他5組存在顯著差異(P<0.05)。過氧化氫酶活性隨豆粕替代量增加先增強(qiáng)后減弱，肝臟中過氧化氫酶活性最高為D2組且與其余5組存在顯著差異(P<0.05)；而血清中過氧化氫酶活性最高為D4組，與其余5組差異不顯著(P>0.05)。在血清中，丙二醛含量隨豆粕替代量的變化并無明顯變化，豆粕替代魚粉對(duì)丙二醛影響并不顯著(P>0.05)；在肝臟中，D2組丙二醛含量最高，且與其他幾組差異明顯(P<0.05)。還原型谷胱甘肽活性均值有一定的波動(dòng)，在血清中D1組GSH表達(dá)量最高但與其他5組無顯著差異(P>0.05)；在肝臟中D4組GSH含量最高，與其余5組存在顯著差異(P<0.05)?？偪寡趸芰涤幸欢ǖ牟▌?dòng)，在血清中 T-AOC最高組為D3但與其余5組無顯著差異(P>0.05)；T-AOC在肝臟中最高位D2組，與其他5組存在明顯差異(P<0.05)。

表4 豆粕替代魚粉對(duì)點(diǎn)帶石斑魚腸道淀粉酶活性

表5 豆粕替代魚粉對(duì)點(diǎn)帶石斑魚腸道脂肪酶活性

表6 豆粕替代魚粉對(duì)石斑魚抗氧化指標(biāo)影響

3 討論

3.1 飼料中豆粕替代魚粉比例對(duì)點(diǎn)帶石斑魚生長(zhǎng)性能的影響

蛋白質(zhì)是魚類生長(zhǎng)過程中的關(guān)鍵因素，是構(gòu)成動(dòng)物機(jī)體的成分，同時(shí)還為水產(chǎn)動(dòng)物提供能量。目前，在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中植物蛋白源部分替代魚粉成為研究的熱點(diǎn)。已有相關(guān)研究報(bào)道，當(dāng)膨化豆粕替代魚粉蛋白比例為60%時(shí)，不會(huì)對(duì)虹鱒魚生長(zhǎng)指標(biāo)產(chǎn)生影響[12]。在5%豆粕替代魚粉用量的1/3時(shí)，不影響奧尼羅非魚幼魚及魚種生長(zhǎng)性能，但當(dāng)替代量達(dá)2/3時(shí)，幼魚生長(zhǎng)顯著降低[13]。本試驗(yàn)中，飼料中豆粕替代魚粉對(duì)點(diǎn)帶石斑魚增質(zhì)量率、蛋白質(zhì)效率和特定生長(zhǎng)率有顯著影響，且隨豆粕的替代量的增大呈先增后減的趨勢(shì)，在豆粕替代水平為20%的D2組，增質(zhì)量率、特定生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)效率均為最大值，且餌料系數(shù)降為最低。而當(dāng)替代水平再上升時(shí)，增質(zhì)量率、特定生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)效率都隨之下降，而餌料系數(shù)卻隨之上升，這與鄒文超等的研究結(jié)果[14]相符，其研究結(jié)果表明斜帶石斑魚飼料中豆粕替代魚粉蛋白的比例不宜超過30%，當(dāng)豆粕替代40%魚粉蛋白時(shí)，斜帶石斑魚生長(zhǎng)性能下降。從上述2個(gè)試驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，在石斑魚飼料中豆粕替代魚粉比例適宜時(shí)，不但不會(huì)影響其生長(zhǎng)，反而會(huì)在一定程度上增強(qiáng)其飼料利用能力，進(jìn)而促進(jìn)生長(zhǎng)；但替代比例過高，豆粕存在的多種抗?fàn)I養(yǎng)因子、敗風(fēng)味物質(zhì)可能造成飼料適口性不佳，使得飼料中較高的豆粕比例降低了魚類對(duì)飼料蛋白質(zhì)的消化能力，并且其氨基酸利用效率較低，尤其是蛋氨酸、賴氨酸利用率不足，影響水生動(dòng)物對(duì)飼料的利用，抑制生長(zhǎng)。而楊嚴(yán)鷗等指出在不影響黃顙魚生長(zhǎng)性能的前提下，其飼料中豆粕替代魚粉蛋白含量最高為30%，但過量替代時(shí)，黃顙魚的生長(zhǎng)指標(biāo)同樣會(huì)降低，上述替代量的差異可能是由于試驗(yàn)魚種類不同，養(yǎng)殖條件存在差異等原因[15]。

肥滿度被視為魚類生物學(xué)研究中衡量生長(zhǎng)和攝食強(qiáng)度等健康狀況的1個(gè)指標(biāo)，其變化也預(yù)示著魚體對(duì)于飼料營(yíng)養(yǎng)的利用情況。本研究發(fā)現(xiàn)，肥滿度隨替代水平提高顯著上升，而劉汝鵬等及王桂芹等對(duì)翹嘴鲌的研究發(fā)現(xiàn)豆粕替代魚粉水平未對(duì)肥滿度產(chǎn)生顯著性影響，但亦成升高趨勢(shì)[16-17]。綜合上述生長(zhǎng)指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，適宜豆粕替代魚粉比例能夠增強(qiáng)魚的攝食強(qiáng)度，進(jìn)而使魚體獲得更好的生長(zhǎng)及肥滿度；但替代比例過高，隨肥滿度仍呈升高趨勢(shì)，但魚體生長(zhǎng)性能出現(xiàn)下降，表明從表觀來看魚體獲得良好的肥滿度，并不是因?yàn)轱暳侠媚芰Φ脑鰪?qiáng)，而可能是因?yàn)轱暳系鞍踪|(zhì)或糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹净蛘咛窃罘e在肝臟或內(nèi)臟中等原因造成的，其具體的影響機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3.2 飼料中豆粕替代魚粉比例對(duì)點(diǎn)帶石斑魚消化酶活性的影響

在豆粕替代魚粉的過程中，胰蛋白酶抑制因子、皂角苷、大豆凝集素等豆粕自身含有的抗?fàn)I養(yǎng)因子均會(huì)成為抑制水產(chǎn)動(dòng)物蛋白酶分泌及活性的重要因素，如Sveier在對(duì)大西洋鮭魚的研究中發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶抑制因子既可以通過在腸道中與蛋白酶直接結(jié)合的方式降低蛋白酶活性，又可以通過影響肝胰臟發(fā)育抑制蛋白酶的合成與分泌[18]。在腸道中，前腸作為其中主要消化蛋白的部分，本研究中發(fā)現(xiàn)豆粕替代水平的升高會(huì)降低點(diǎn)帶石斑魚前腸蛋白酶活性，而中腸及后腸蛋白酶活性則隨之呈顯著上升趨勢(shì)，但腸道蛋白酶活性總體仍呈下降趨勢(shì)，推測(cè)魚體會(huì)通過調(diào)節(jié)腸道中不同部位的蛋白酶合成及分泌來適應(yīng)飼料中蛋白源的變化。這與鄒文超對(duì)斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)的研究結(jié)果[19]相似。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白源變化在引起蛋白酶活性變化的同時(shí)，也會(huì)引起使其他消化酶活性產(chǎn)生相應(yīng)變化，如當(dāng)豆粕替代魚粉蛋白比例達(dá)到20%時(shí)會(huì)顯著提高前腸中淀粉酶活性，揭示豆粕替代比例的升高會(huì)增加飼料中的淀粉含量，進(jìn)而誘導(dǎo)魚體內(nèi)淀粉酶的合成。而錢曦等在對(duì)翹嘴鲌(ErythroculterilishaeformisBleeker)的研究中發(fā)現(xiàn)，腸道淀粉酶活性并不因豆粕替代魚粉比例的提高而有顯著性變化[20]，究其主要原因是魚種的差異，相較于肉食性的點(diǎn)帶石斑魚，雜食性的翹嘴鲌?bào)w內(nèi)的淀粉酶活性較高[21]，能夠更好地適應(yīng)飼料中淀粉含量的增加。此外，當(dāng)豆粕替代魚粉比例達(dá)到20%時(shí)也會(huì)顯著提高與前腸、中腸及后腸的脂肪酶活性，其具體影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.3 飼料中豆粕替代魚粉比例對(duì)點(diǎn)帶石斑魚抗氧化能力的影響

魚類體內(nèi)抗氧化酶的缺乏會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)原有的自由基代謝平衡遭到破壞；正常情況下，體內(nèi)產(chǎn)生的自由基即活性氧可被非酶性或酶性抗氧化系統(tǒng)清除掉，其中SOD和GSH-Px是魚體內(nèi)的主要抗氧化酶，SOD能催化超氧陰離子產(chǎn)生歧化反應(yīng)，清除超氧陰離子，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。GSH-Px能特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對(duì)H2O2的還原反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[22-23]。在本試驗(yàn)的豆粕替代梯度中，各替代梯度的血清的抗氧化能力指標(biāo)基本沒有明顯變化，而肝臟中GSH值先減后增，SOD與MDA值則是先增后減。綜合來看，豆粕替代20%魚粉對(duì)點(diǎn)帶石斑魚的抗氧化能力比較有利。上述研究表明，在點(diǎn)帶石斑魚飼料中用豆粕部分替代魚粉，可改善魚體抗氧化能力，且在適當(dāng)替代范圍內(nèi)抗氧化能力的改善程度與替代比例間存在同步性，但替代量過高后豆粕自身含有的抗?fàn)I養(yǎng)因子除了會(huì)影響魚類消化能力外，也會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)或是炎癥的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制魚體非特異性免疫性能，這與對(duì)斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[21]及中華鱉(TrionyxSinensis)[24]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究中，以豆粕替代20%魚粉蛋白時(shí)，能顯著提高點(diǎn)帶石斑魚的生長(zhǎng)性能又不會(huì)對(duì)點(diǎn)帶石斑魚的消化酶活性及抗氧化能力產(chǎn)生明顯影響；而且從生長(zhǎng)性能、消化酶和抗氧化能力不受影響的角度考慮，點(diǎn)帶石斑魚飼料中豆粕替代魚粉蛋白的比例不宜超過20%。