楊 穎， 陸 江， 李湘萍， 佘 納， 唐核心， 石德順， 呂祁峰， 徐照學(xué)

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004； 2.上海交通大學(xué)附屬上海市第九人民醫(yī)院，上海 200002；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院麻醉學(xué)研究所及附屬太和醫(yī)院麻醉科，湖北十堰 442000； 4.河南省畜牧研究所，河南鄭州 476800)

南陽(yáng)黃牛為中國(guó)五大良種黃牛之一，2006年被列入國(guó)家畜禽遺傳資源保護(hù)名錄，役肉兼用。肉牛的生長(zhǎng)性狀和屠宰性狀是其最重要經(jīng)濟(jì)性狀之一。而牛的胴體和肉質(zhì)都受遺傳因素影響，并可以從DNA水平上加以選擇、操作[1-2]。組蛋白去乙?；诨蜣D(zhuǎn)錄及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化方面發(fā)揮重要作用[3-6]。組蛋白去乙?；?HDAC)與基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)有關(guān)。研究表明，不活躍的染色質(zhì)呈去乙?；癄顟B(tài)，而轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域核小體組蛋白高度乙?；痆3-6]。本試驗(yàn)主要探討南陽(yáng)黃牛HDAC1基因的區(qū)域位點(diǎn)多態(tài)性，以及其與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)性，以期為南陽(yáng)黃牛的遺傳育種和改良提供參考，為新品系的培育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

河南南陽(yáng)純種黃牛血液樣品15頭份，均來(lái)自南陽(yáng)黃牛保種場(chǎng)。

1.2 引物設(shè)計(jì)

HDAC1基因Intron 4-Intron 5區(qū)擴(kuò)增片段引物：

上游引物：5′-GGACTTTGTGACAGGCTTG-3′，下游引物：5′-GGAGAGGGAAGTGGGAAC-3′，Tm：60 ℃。

HDAC1基因Intron 10-Intron 11區(qū)擴(kuò)增片段引物：

上游引物：5′-CCACACACCCCTAATTGAA-3′，下游引物：5′-GCAAGTCAGAAGAGCCTACA-3′，Tm：57 ℃。

HDAC1基因3′UTR區(qū)擴(kuò)增片段引物：

上游引物：5′-GGGCACACATTACTTTTCTAGTA-3′，下游引物：5′-TGTACCATTTTATTACAAAGATTC-3′，Tm：55 ℃。

1.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物處理及DNA序列比對(duì)

由北京艾德萊生物科技有限公司瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒完成純化、回收，回收后由寶生物公司進(jìn)行DNA測(cè)序，經(jīng)過(guò)Ebi在線(xiàn)軟件比對(duì)分析。

1.4 SSCP-PAGE

蛋白產(chǎn)物加入變性緩沖液后高溫變性，10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后硝酸銀染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

依據(jù)參考文獻(xiàn)[1-2]所述方法利用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，具體模型：Y=μ+G+bX+e，其中Y為性狀表型值，μ為平均值，G為基因型效應(yīng)(包括加性效應(yīng)和顯性效應(yīng))，b為屠宰體質(zhì)量的回歸系數(shù)，X為屠宰體質(zhì)量，e為殘差。

2 結(jié)果與分析

2.1 南陽(yáng)黃牛HDAC1基因Intron 4-Intron 5片段位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)

通過(guò)測(cè)序比對(duì)分析，未發(fā)現(xiàn)Intron 4-Intron 5片段存在位點(diǎn)多態(tài)性(表1)。

表1 南陽(yáng)黃牛HDAC1基因Intron 4-Intron 5片段序列比對(duì)

南陽(yáng)黃?；旌螪NAHDAC1基因Intron 4-Intron 5片段PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)復(fù)合多條帶，未出現(xiàn)多態(tài)性(圖1-B)。結(jié)合DNA-PCR產(chǎn)物測(cè)序和PCR-SSCP方法，在已測(cè)南陽(yáng)黃牛群體中，HDAC1基因在Intron 4-Intron 5片段無(wú)多態(tài)性位點(diǎn)。

2.2 南陽(yáng)黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11片段的位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)

南陽(yáng)黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收測(cè)序，經(jīng)Ebi在線(xiàn)軟件比對(duì)分析得出，HDAC1基因在Intron 10-Intron 11片段依自己測(cè)序順序的第110 bp處有1個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，為A/G突變(表2)。

根據(jù)測(cè)序圖譜判斷，多態(tài)性位點(diǎn)基因型分別為：GG純合子、AA純合子和AG雜合子3種基因型(圖2-B至圖2-D)。

2.3 南陽(yáng)黃牛HDAC1基因3′-UTR非翻譯區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)

南陽(yáng)黃牛HDAC1基因3′非翻譯區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后測(cè)序，經(jīng)過(guò)Ebi在線(xiàn)軟件比對(duì)分析結(jié)果。由表3可知，在南陽(yáng)黃牛目標(biāo)群體中HDAC1基因3′-UTR非翻譯區(qū)序列有2個(gè)突變位點(diǎn)。結(jié)合測(cè)序圖譜，依自己測(cè)序順序的第49 bp處位點(diǎn)基因型分別存在A/C堿基型突變，基因型分別為AA純合子、AC雜合子(圖3-B、圖3-C)；第 199 bp 處位點(diǎn)存在T/C堿基多態(tài)性，基因型為T(mén)T純合子和TC雜合子(圖3-D、圖3-E)。

2.4 南陽(yáng)黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11區(qū)和3′-UTR非翻譯區(qū)基因型頻率分布

統(tǒng)計(jì)分析，南陽(yáng)黃牛HDAC1基因的Intron 10-Intron 11區(qū)和3′-UTR非翻譯區(qū)的堿基多態(tài)性位點(diǎn)基因及基因型頻率。由表4可知，Intron 10-Intron 11區(qū)110 bp處的A/G多態(tài)性位點(diǎn)基因型為GG的個(gè)體占53%，基因型為AG的個(gè)體占33%，純合子AA基因型占比最小，僅占14%。其中G等位基因核苷酸占總堿基數(shù)的70%，A等位基因核苷酸占總堿基數(shù)的30%。

由表5可知，在3′-UTR非翻譯區(qū)的2個(gè)SNP位點(diǎn)中，在 49 bp位點(diǎn)處的A/C突變， AA基因型頻率(67%)遠(yuǎn)大于AC基因型(33%)，而CC基因型的頻率為0%；在核苷酸總百分比上，84%為A核苷等位基因，C核苷等位基因僅占16%。

由表6可知，在3′-UTR非翻譯區(qū)第199 bp位點(diǎn)處的T/C多態(tài)性突變中，未發(fā)現(xiàn)CC基因型，TT基因型和TC基因型分別占到了58%和42%；在總核苷酸數(shù)量的比例上，T核苷等位基因占到了79%，C核苷等位基因僅占到了21%。

2.5 南陽(yáng)黃牛HDAC1基因多態(tài)位點(diǎn)與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)分析

2.5.1 南陽(yáng)黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11區(qū)A/G(110 bp)SNP突變位點(diǎn)與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)性分析 應(yīng)用SAS軟件reg和glm程序，進(jìn)行南陽(yáng)黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11區(qū)不同突變位點(diǎn)基因型與包括胸圍、坐骨端寬、體高、體長(zhǎng)等表現(xiàn)型性狀進(jìn)行遺傳效應(yīng)估計(jì)和關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果表明，AG基因型的南陽(yáng)黃牛，腰角寬(cm)和體長(zhǎng)(cm)明顯高于AA基因型(P<0.05)。GG基因型的南陽(yáng)黃牛，日增質(zhì)量(kg)明顯高于AG基因型(P<0.05)。其余生長(zhǎng)性狀在不同基因型個(gè)體中比較無(wú)顯著差異。A加性效應(yīng)和A/G顯性效應(yīng)在體長(zhǎng)(cm)、腰角寬(cm)、日增質(zhì)量(kg)生長(zhǎng)性狀上存在差異顯著(表7)。上述加性和顯性效應(yīng)結(jié)果提示此SNP突變位點(diǎn)可為分子育種培育優(yōu)秀品種提供一定的參考價(jià)值。

2.5.2 南陽(yáng)黃牛HDAC1基因3′-UTR區(qū)A/C(49bp)SNP突變位點(diǎn)與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)性分析 分析發(fā)現(xiàn)，體長(zhǎng)性狀A(yù)C基因型群體比AA基因型群體明顯升高，二者差異極顯著(P<0.01)。體高(cm)、尻長(zhǎng)(cm)、十字部高(cm)和日增質(zhì)量(kg)，AC基因型群體比AA基因型群體升高明顯，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，但它們均沒(méi)能達(dá)到極顯著水平。AC基因型相較于AA基因型群體，在經(jīng)濟(jì)性狀方面有如此多的顯著優(yōu)異特性，提示此SNP多態(tài)性位點(diǎn)可為分子育種提供參考(表8)。

2.5.3 南陽(yáng)黃牛HDAC1基因3′-UTR區(qū)T/C(199 bp)SNP突變位點(diǎn)與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)性分析 由表9可知，與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)不同基因型個(gè)體在各性狀中均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 南陽(yáng)黃牛HDAC1基因3′-UTR非翻譯區(qū)序列比對(duì)

3 結(jié)論與討論

基因加性效應(yīng)又稱(chēng)為“育種值”，是等位基因的累加效應(yīng)，上下代可以固定遺傳。本研究中南陽(yáng)黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11區(qū)A/G(110 bp)SNP突變位點(diǎn)出現(xiàn)3種基因型，雜合子AG和純合子AA、純合子GG。結(jié)果表明，AG基因型的南陽(yáng)黃牛在腰角寬(cm)和體長(zhǎng)(cm)顯著高于AA基因型(P<0.05)。GG基因型的南陽(yáng)黃牛日增質(zhì)量(kg)顯著高于AG基因型(P<0.05)。其余生長(zhǎng)性狀在不同基因型個(gè)體中比較無(wú)顯著差異。A加性效應(yīng)正值說(shuō)明純合型AA比GG有增加性狀值的趨勢(shì)，負(fù)值則反之。若加性效應(yīng)達(dá)到顯著水平(P<0.05)，表示其可信度>95%，育種值高。A加性效應(yīng)和A/G顯性效應(yīng)在體長(zhǎng)(cm)、腰角寬(cm)、日增質(zhì)量(kg)生長(zhǎng)性狀上存在差異顯著[1-2]。顯性效應(yīng)是基因位點(diǎn)內(nèi)等位基因之間的互作效應(yīng)，能遺傳但不能固定，是主要產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)的部分[1-2]。本研究中南陽(yáng)黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11區(qū)A/G(110 bp)SNP突變位點(diǎn)A/G顯性效應(yīng)在體長(zhǎng)(cm)、腰角寬(cm)、日增質(zhì)量(kg)生長(zhǎng)性狀上存在差異顯著。上述加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)結(jié)果提示，此南陽(yáng)黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11區(qū)A/G(110 bp)SNP突變位點(diǎn)可能為分子育種培育優(yōu)秀品種提供一定的參考價(jià)值[7-10]。

本試驗(yàn)在南陽(yáng)黃牛HDAC1基因3′-UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)了2個(gè)突變位點(diǎn)，分別為A/C(49 bp)SNP和T/C(199 bp)SNP突變位點(diǎn)[1，11-15]。應(yīng)用SAS軟件分析了南陽(yáng)黃牛HDAC1基因 3′-UTR 區(qū)A/C(49 bp)SNP和T/C(199 bp)SNP 2個(gè)突變位點(diǎn)與腰角寬、尻長(zhǎng)、十字部高、日增質(zhì)量、體質(zhì)量、體長(zhǎng)、體高、胸圍、坐骨端寬、管?chē)壬L(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)評(píng)估分析發(fā)現(xiàn)，南陽(yáng)黃牛HDAC1基因3′-UTR區(qū)A/C(49 bp)SNP突變位點(diǎn)對(duì)南陽(yáng)黃牛體長(zhǎng)性狀產(chǎn)生極顯著影響，即AC基因型群體比較于AA基因型群體，體長(zhǎng)增加極顯著(P<0.01)。在體高(cm)、尻長(zhǎng)(cm)、十字部高(cm)和日增質(zhì)量(kg)方面，AC基因型比AA基因型升高亦明顯，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，但沒(méi)能達(dá)極顯著水平。AC基因型相較于AA基因型群體，在經(jīng)濟(jì)性狀方面有如此多的顯著優(yōu)異特性，提示此SNP多態(tài)性位點(diǎn)可為分子育種提供重要參考，可作為提高經(jīng)濟(jì)性狀的優(yōu)良育種目標(biāo)基因選擇[1，16-20]。

表4 南陽(yáng)黃牛Intron 10-Intron 11區(qū)A/G(110 bp)多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率分布

表5 南陽(yáng)黃牛3′-UTR非翻譯區(qū)A/C(49 bp)突變位點(diǎn)基因 型頻率和等位基因頻率分布

表6 南陽(yáng)黃牛3′-UTR非翻譯區(qū)T/C(199 bp)突變位點(diǎn)基因 型頻率和等位基因頻率分布表

表7 南陽(yáng)黃牛HDAC1基因Intron 10-Intron 11區(qū)A/G(110 bp)SNP突變位點(diǎn)與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果

注：估計(jì)值均為最小二乘均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。在同一比較組內(nèi)，字母不同表示二者之間差異顯著；其中小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。在基因效應(yīng)比較中，加性效應(yīng)正值表示A等位基因升高性狀表型值；加性效應(yīng)負(fù)值表示A等位基因降低性狀表型值；“*”表示P<0.05，效應(yīng)顯著。下表同。

南陽(yáng)黃牛HDAC1基因mRNA 3′-UTR非翻譯區(qū)T/C(199 bp)SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，各性狀在不同基因型群體的均值均無(wú)顯著差異。因此，本研究提示此SNP多態(tài)性位點(diǎn)不可成為分子育種的理想基因型標(biāo)記選擇。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)可能直接影響表達(dá)水平或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化[7-10，16-20]。本研究在南陽(yáng)黃牛HDAC1基因Intron 4-Intron 5區(qū)SNP位點(diǎn)多態(tài)性的檢測(cè)中，使用PCR-SSCP的方法分析是否存在多態(tài)性，以及聯(lián)合PCR產(chǎn)物直接測(cè)序方法同時(shí)使用，可以盡量避免假陰性結(jié)果。

表8 南陽(yáng)黃牛HDAC1基因3′-UTR區(qū)A/C(49 bp)SNP 突變位點(diǎn)與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)性分析

注：CC基因型頻率為0%。

表9 南陽(yáng)黃牛HDAC1基因3′-UTR區(qū)T/C(199 bp)SNP 突變位點(diǎn)與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)性分析

注：CC基因型頻率為0%。