黎 露，韓濤濤，吳思雯，唐青海，楊 海，何麗芳，劉 最，王芳宇，張 倩

（衡陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南衡陽(yáng) 421008）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染引起的多種家畜的急性傳染病，1周齡內(nèi)仔豬易感，多出現(xiàn)發(fā)熱、奇癢、昏睡、共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀，妊娠母豬后期感染可發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎，甚至木乃伊胎[1]。以往，育肥豬感染一般不發(fā)生死亡，僅出現(xiàn)增重減慢、體溫升高等輕微癥狀[2-3]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，PRV對(duì)育肥豬的致病性顯著增強(qiáng)，并以呼吸道和發(fā)育障礙為主要癥狀[4]，但僅靠臨床診斷，無(wú)法確診PRV感染，需要借助實(shí)驗(yàn)室診斷。

目前，PR主要依靠接種商品化的減毒活疫苗和基因缺失疫苗進(jìn)行預(yù)防。PRV核酸為雙鏈 DNA，其編碼的gE蛋白是一種重要的神經(jīng)毒性因子，在基因缺失疫苗毒株中，該基因通常被剔除[5-6]。因此，在實(shí)驗(yàn)室診斷中，通常采用PCR檢測(cè)gE基因，以區(qū)分野毒和疫苗毒，亦可配合gE蛋白特異性抗體檢測(cè)進(jìn)行鑒別診斷[7-8]。2017年4月衡陽(yáng)市某豬場(chǎng)育肥豬發(fā)生疑似PR疫情。為確診疫情，采集發(fā)病豬脾臟進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

Vero細(xì)胞：衡陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存；PRV強(qiáng)毒株陽(yáng)性對(duì)照和PRV陽(yáng)性血清：衡陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存；血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒：購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清：購(gòu)自Gibico公司；MEM培養(yǎng)基：購(gòu)自北京清大天一科技有限公司；Premix Ex Taq酶：購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；體重1.5 kg左右雌性新西蘭大白兔：購(gòu)自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 病料采集與處理 采集發(fā)病豬脾臟，研磨加入MEM 細(xì)胞培養(yǎng)液制成組織懸液，反復(fù)凍融 3 次后，3 000 r/min離心2 min，取上清，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，濾液于-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取與PCR檢測(cè) 取1.2.1中濾液200μL，用血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒提取DNA樣本。根據(jù) GenBank 中PRV HN1201毒株的基因組序列（KP722022.1）設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物（PRV-gE-F/R和PRV-gG-F/R）進(jìn)行PCR檢測(cè)（表1）。PCR反應(yīng)體系包含：模板DNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃保存。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 病毒分離培養(yǎng)與血清學(xué)鑒定 當(dāng)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為80%的匯合度時(shí)，去培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，加入無(wú)血清MEM培養(yǎng)基，按照體積比10:1的比例加入1.2.1中濾液，搖勻后，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d觀察1次。當(dāng)80%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）時(shí)，收集培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，取凍融物接種健康細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將分離的病毒，采用免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞染色法（IPMA）進(jìn)行血清學(xué)鑒定，根據(jù)文獻(xiàn)[16]改進(jìn)后進(jìn)行。將Vero細(xì)胞接種35 mm培養(yǎng)皿中，當(dāng)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為80%的匯合度時(shí)，接種培養(yǎng)物，1 d后棄培養(yǎng)基；將細(xì)胞用2 mL PBS洗滌3次，真空干燥，加入1.5 mL 30 %丙酮-PBS固定30 min，干燥，加入1.5 mL 稀釋好的PRV多克隆抗體（1∶100），37 ℃孵育1 h；用PBS洗滌3次，加入1.5 mL酶標(biāo)二抗HRP-SPA（1∶3 000），37 ℃孵育1 h；用PBS洗滌3次，加入1.5 mL AEC底物顯色液，37 ℃孵育15 min；棄掉反應(yīng)液，用蒸餾水洗滌1次，在顯微鏡觀察結(jié)果。

表1 引物序列及其反應(yīng)條件

1.2.4 家兔感染試驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)家兔分成3組，每組2只：A組腹腔注射F3代分離培養(yǎng)物1 mL，B組注射F3代分離培養(yǎng)物4 mL，C組為不接種對(duì)照。每隔12 h觀察癥狀。待出現(xiàn)明顯臨床癥狀后，進(jìn)行剖檢觀察病理變化，并取心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織，提取DNA進(jìn)行PRV核酸檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)

取病料處理液進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)病豬脾臟組織為PRV-gE和gG基因核酸陽(yáng)性（圖1）。

2.2 病毒細(xì)胞培養(yǎng)與血清學(xué)鑒定

將處理過(guò)的病料接種Vero細(xì)胞，培養(yǎng)3 d，發(fā)現(xiàn)接種細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變——細(xì)胞變圓、脫落、拉絲、融合成合胞體（圖2-A），未接種病毒對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)正常（圖2-B）。連續(xù)接種培養(yǎng)3代，均表現(xiàn)出一致CPE。

IPMA結(jié)果顯示，接種病毒的培養(yǎng)皿中，被感染的Vero細(xì)胞反應(yīng)呈陽(yáng)性，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均染成棕紅色，細(xì)胞質(zhì)著色濃于細(xì)胞核，未感染的細(xì)胞無(wú)著色（圖3-A）。未接種病毒的對(duì)照細(xì)胞無(wú)任何著色（圖3-B）。

圖1 脾臟組織病料中PRV核酸的PCR檢測(cè)

圖2 病毒的分離培養(yǎng)

圖3 細(xì)胞傳代病毒（F3代）的血清學(xué)鑒定

2.3 家兔感染試驗(yàn)

2.3.1 臨床癥狀 A組家兔：腹瀉，偶有瘙癢，用爪子撓腹部，撓癢頻率較高，接種病毒后約60 h死亡。B組精神萎靡，腹瀉、食欲不振，只飲水，劇烈撓腹部，隨后四肢麻痹，角弓反張死亡，接種病毒后30 h死亡。健康對(duì)照兔子觀察1周無(wú)任何癥狀，存活。

2.3.2 家兔臟器的PRV-gE核酸檢測(cè) PCR檢測(cè)結(jié)果表明，A組中肝臟和脾臟為PRV-gE核酸陽(yáng)性，心臟、肺臟、腎臟為PRV-gE陰性（圖4）；B組中肝臟、脾臟、肺臟為PRV-gE核酸陽(yáng)性，心臟、腎臟為PRV-gE陰性（圖5）。

圖4 A組臟器中PRV-gE PCR核酸檢測(cè)

圖5 B組臟器中PRV-gE核酸的PCR檢測(cè)

3 討論

本研究應(yīng)用病毒分離傳代培養(yǎng)、PCR檢測(cè)和動(dòng)物感染試驗(yàn)等方法，對(duì)一例疑似PRV感染病例進(jìn)行了鑒定。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果表明，該病例為PRV野毒感染。

發(fā)病豬脾臟組織樣品的PRV-gE和PRV-gG核酸陽(yáng)性。病料接種Vero細(xì)胞3 d后，出現(xiàn)典型的PRV細(xì)胞病變——細(xì)胞變圓和細(xì)胞融，且培養(yǎng)物連續(xù)培養(yǎng)3代，均表現(xiàn)出穩(wěn)定的特征性CPE。這與其他研究人員將病毒接種到MDCK、雞胚成纖維細(xì)胞、BHK-21、PK-15也出現(xiàn)同樣CPE的結(jié)果一致[9-11]。

用分離培養(yǎng)的PRV F3代病毒感染家兔，可使家兔出現(xiàn)腹瀉、奇癢、四肢麻痹神經(jīng)癥狀，而未感染家兔精神狀況良好。A組家兔從接種PRV到死亡共存活60 h，B組家兔存活30 h，與劉瀾等[12]、祁賢等[13]報(bào)道的結(jié)果相似。但本試驗(yàn)未觀察到江煥賢等[14]報(bào)道的接種部位被毛脫落、皮膚撕破等現(xiàn)象。推測(cè)這可能是其在研究過(guò)程中病毒接種劑量較大引起的。取感染家兔的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)A組肺臟為PRV-gE核酸陰性，而B組為PRV-gE核酸陽(yáng)性，且B組中肺臟病毒含量比其他臟器大。郭麗靜[15]采用PRV強(qiáng)毒株對(duì)4頭19日齡未免疫的斷奶仔豬攻毒，取攻毒仔豬扁桃體等臟器組織進(jìn)行PRV-gE核酸檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)脾臟檢出率為100%，而肺臟檢出率僅為50%。這種病毒臟器分布的差異性可能跟病毒的感染嗜性、接種劑量及病程有關(guān)，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。