趙玉清

（青海省海北藏族自治州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，青海海北 812200）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus）的DNA病毒，其基因組為環(huán)狀單鏈DNA分子，長(zhǎng)度約1 767 bp，主要有Rep和Cap兩個(gè)基因完成病毒的復(fù)制組裝等功能[1-2]。PCV有多種血清型，如PCV1、PCV2和PCV3型等。其中：PCV1無(wú)致病性；PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning pigs multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要毒株[3-4]；PCV3是在美國(guó)首先報(bào)道發(fā)現(xiàn)的新毒株，能引起豬的皮炎腎病綜合征、繁殖障礙及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，目前在我國(guó)河北、福建、廣西等多個(gè)省份都能檢測(cè)到，與PCV1和PCV2處于不同的進(jìn)化分支，屬于新型PCV[5-8]。

PCV主要通過(guò)垂直傳播（透過(guò)胎盤屏障）和水平傳播（通過(guò)陽(yáng)性帶毒豬的鼻腔液、糞便和尿液等排泄物）而感染其他豬群[9-10]。血清流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)：德國(guó)豬群的PCV血清抗體陽(yáng)性率高達(dá)85%，英國(guó)為86%，北愛(ài)爾蘭為92%；我國(guó)江西、天津、北京、山東、河南、河北、吉林、福建等8個(gè)省份豬群的抗體陽(yáng)性率都在50%以上[11-13]?？梢?jiàn)，PCV在全球流行廣泛，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。

本研究對(duì)青海省不同豬場(chǎng)發(fā)病豬群樣品，通過(guò)PCR檢測(cè)PCV2 ORF2基因，分析基因序列、氨基酸序列和進(jìn)化樹(shù)，從而為我國(guó)PCV感染的診斷、預(yù)防控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料與毒株

采自青海省3個(gè)豬場(chǎng)的發(fā)病豬群。對(duì)表現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、精神沉郁、行動(dòng)遲緩、皮膚蒼白、被毛臟亂、厭食消瘦、生長(zhǎng)遲緩的豬進(jìn)行剖檢，采集剖檢豬的淋巴、脾臟、腎臟和肝臟組織。每個(gè)豬場(chǎng)采集樣品6份，共18份樣品，用PBS液勻漿離心（5 000 r/min，20 min）取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

PCR-Premix Taq?（TaKaRa Taq? Version 2.0 plus dye）和DNA marker DL 2000：購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒：購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。其他均為國(guó)產(chǎn)常規(guī)試劑。PCR引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序，均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。主要儀器包括PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、離心機(jī)、電子天平、蒸汽滅菌器、干燥箱、無(wú)菌操作臺(tái)、微量移液器等。

1.3 分子鑒定

參照糞便基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書，提取糞便基因組DNA并以此作為模板。VP2基因擴(kuò)增全長(zhǎng)片段預(yù)期為702 bp。引物如下：PCVCapF：5'- ATGACGTATCCAAGGAGGC-3'和 PCVCapR：5'- TTAGGGTTTAAGTGGGGGGT-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50.0 μL）如下：Premix Taq 25.0 μL，上下游引物（濃度 10.0 μmol/L）各 2.0 μL，模板 DNA 3.0 μL，補(bǔ)充水 18.0 μL。擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳（電壓120 V，時(shí)間30 min），電泳完成后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果并拍照。PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序委托金唯智生物科技有限公司完成，采用Sanger雙脫氧鏈終止法進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)峰圖分析后，在GenBank上采用BLAST方法（https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源序列搜索；應(yīng)用MEGA 5.0軟件和Clustal Omega在線軟件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析。

1.4 PCV2-Cap蛋白特性分析

利用Prot Param程序（http://web.expasy.org/protparam/）計(jì)算VP2蛋白的分子量、等電點(diǎn)和氨基酸組成等理化指標(biāo)；用SignalP程序（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和DAS-TMfilter server程 序（http://mendel.imp.ac.at/sat/DAS/DAS.html）分析其信號(hào)肽位點(diǎn)及跨膜結(jié)構(gòu)；用SOPMA軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html）進(jìn)行EM19抗原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。通過(guò)ABCPred軟件（http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html）對(duì)VP2蛋白的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.5 進(jìn)化分析

對(duì)克隆的PCV-Cap基因序列與已發(fā)表的PCV1和PCV2參考株的Cap基因序列和氨基酸序列，利用軟件中的 Meg Align 功能分別進(jìn)行比對(duì)；利用MEGA 5.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；選擇Kimura 2-parameter模式，進(jìn)行重復(fù)2 000次的自舉檢驗(yàn)，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析PCV分離毒株和不同經(jīng)典毒株的親緣關(guān)系及進(jìn)化特點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 分子鑒定

利用基因組DNA提取試劑盒，對(duì)病料提取DNA后，基于特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可以獲得預(yù)期大小的片段（圖1），并發(fā)現(xiàn)有4個(gè)組織樣品呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為22.2%（4/18）。將4個(gè)陽(yáng)性樣品進(jìn)行膠回收測(cè)序，經(jīng)過(guò)序列測(cè)定獲得完整的Cap基因核苷酸序列全長(zhǎng)為705 bp，與GenBank參考毒株（PCV2）的核苷酸序列同源性均在99%以上，將其命名為PCV2-QH1株。

圖1 臨床病料樣品PCV-Cap基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)鑒定結(jié)果

2.2 PCV2-Cap蛋白特性

經(jīng)過(guò)ExpASy在線系統(tǒng)分析，PCV2-Cap蛋白長(zhǎng)度為234個(gè)氨基酸，分子量大小約為28.06 kDa，等電點(diǎn)（pI）為10.84；帶正（Arg+ Lys）負(fù)（Asp + Glu）電荷氨基酸殘基數(shù)分別為41個(gè)和16個(gè)。假定所有的半胱氨酸都形成二硫鍵，PCV2-Cap蛋白在280 nm處的摩爾消光系數(shù)為48 360 L·mol-1·cm-1及 0.1% 濃度（1g/L）的Abs值為1.724；假定所有的二硫鍵打開(kāi)時(shí)，蛋白在280 nm處的摩爾消光系數(shù)為 48 360 L·mol-1·cm-1及 0.1%濃 度（1g/L） 的 Abs值 為 1.724。PCV2-Cap蛋白在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為56.61，推測(cè)PCV2-Cap蛋白為不穩(wěn)定蛋白。PCV2-Cap蛋白的脂肪族指數(shù)為65.30，親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.844，蛋白總體親水性非常高，可溶于水。PCV2-Cap蛋白序列信號(hào)肽預(yù)測(cè)值為0.182（cutoff值為0.450），不具有信號(hào)肽位點(diǎn)；軟件DAS-TMfilter server也顯示其不具有潛在的信號(hào)肽。PCV2-Cap蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，α螺旋比例為7.26%，β轉(zhuǎn)角比例為4.70%，無(wú)規(guī)則卷曲比例為61.54%，延伸鏈比例為26.50%?？梢?jiàn)，PCV2-Cap蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主。根據(jù)ABC Pred在線軟件預(yù)測(cè)出抗原表位結(jié)果見(jiàn)表1，有多個(gè)有效的抗原表位。

2.3 PCV-Cap基因進(jìn)化關(guān)系分析

通過(guò)Clustal Omega軟件，將分離毒株P(guān)CV2-QH1的Cap基因與GenBank中相關(guān)毒株Cap基因的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)核苷酸同源性均在99%以上，氨基酸序列同源性均為100%，無(wú)氨基酸突變（表2）。進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，PCV-QH1分離株與PCV2美國(guó)分離株（KU697156）組成一個(gè)微小分支，并與其它PCV2分離株處于同一個(gè)大支上，從進(jìn)化角度上鑒定此分離株屬PCV2株（圖2）。

3 討論與結(jié)論

PCV對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大危害，除了引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征外，還能造成豬生殖系統(tǒng)紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)病變和呼吸道疾病綜合征，以及腸炎和增生性壞死性肺炎，也能引起豬皮炎腎病綜合征等[14]。已有研究表明，豬群除了會(huì)同時(shí)感染不同基因型的PCV（PCV1，PCV2a/b）外，還會(huì)與豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬細(xì)小病毒等形成共同感染[15]，對(duì)于屬單鏈DNA病毒PCV基因組中的基因易造成突變、插入和缺失等變異現(xiàn)象；同時(shí)隨著各種疫苗的大規(guī)模普遍使用，新的變異重組毒株可能經(jīng)常出現(xiàn)。

表1 基于ABCPred軟件分析PCV2-Cap蛋白B細(xì)胞抗原表位結(jié)果

表2 PCV2-QH1與不同毒株Cap基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比較 單位：%

圖2 豬圓環(huán)病毒PCV-Cap基因的進(jìn)化分析

臨床實(shí)踐中，從豬組織細(xì)胞中純化分離培養(yǎng)PCV較困難，所以本研究對(duì)疑似PCV感染組織病料直接進(jìn)行DNA基因組的提取及PCV特異性引物的篩選鑒定，通過(guò)測(cè)序確定為PCV2。該方法適用于分子流行病學(xué)調(diào)查研究，有助于基因和蛋白序列比較及遺傳進(jìn)化分析，同時(shí)可節(jié)省時(shí)間。

本研究表明，PCV2-Cap基因核苷酸序列與不同國(guó)家或地區(qū)的同源性均在99%以上，而蛋白序列同源性均為100%，無(wú)氨基酸突變。PCV2-Cap蛋白為病毒的衣殼蛋白，是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，也是主要的抗原表位。本地區(qū)PCV的Cap蛋白的氨基酸序列無(wú)突變，說(shuō)明使用市場(chǎng)通用疫苗可收到良好的免疫效果。

同時(shí)，本研究對(duì)不同地區(qū)的PCV分離株進(jìn)行了序列比較分析，并繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，青海株（PCV-QH1）與美國(guó)3株毒株、韓國(guó)毒株聚在一支，表明它們之間的親緣關(guān)系最近；我國(guó)不同地區(qū)的毒株聚在一起，同時(shí)與韓國(guó)毒株親緣關(guān)系較近。歐洲毒株（法國(guó)和英國(guó)）與印度毒株親緣關(guān)系較近，澳大利亞毒株和日本毒株分別聚在一起，親緣關(guān)系較近。在進(jìn)化角度上講，中國(guó)株與韓國(guó)株和美國(guó)株的親緣關(guān)系較近，說(shuō)明中國(guó)株P(guān)CV病毒不是從單一的祖先進(jìn)化而來(lái)的。這表明中國(guó)株與我國(guó)的國(guó)際進(jìn)口引種貿(mào)易相關(guān)，但尚待進(jìn)一步研究。本次對(duì)青海PCV分離株的Cap基因序列、蛋白氨基酸序列和抗原表位及系統(tǒng)進(jìn)化的研究，可為我國(guó)PCV分子流行病學(xué)調(diào)查提供數(shù)據(jù)參考，同時(shí)提示豬場(chǎng)應(yīng)按照疫苗免疫保健計(jì)劃進(jìn)行疫苗免疫預(yù)防。