范 琪，馬彥妮，陳佰鴻，左存武，毛 娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

光與植物的正常生長密不可分，它不僅是植物光合作用的原動力，還能夠調(diào)控植物形態(tài)建成、生物周期節(jié)律、延緩植物衰老、物質(zhì)代謝以及基因的表達(dá)等過程[1-3]。

研究表明，藍(lán)光和紅光對植物的光形態(tài)建成和生長發(fā)育均有調(diào)節(jié)作用，但不同光質(zhì)對植物的作用效果不同，紅光能提高植物的光合效率并能促進試管苗的伸長生長和不定根的形成[4]；此外，紅光能夠促進植物形成愈傷組織，但當(dāng)其與藍(lán)光配比使用時，在一定范圍內(nèi)藍(lán)光比例越大導(dǎo)致葉片愈傷組織誘導(dǎo)率越低[5-6]。藍(lán)光能誘導(dǎo)植物葉片氣孔開啟，對葉綠素、碳水化合物和蛋白質(zhì)的形成以及光合節(jié)律等生理過程均有調(diào)控作用[7-8]。藍(lán)光不僅能促進光合基因的表達(dá)，還有利于葡萄試管苗中白藜蘆醇的形成以及干物質(zhì)積累[9]。有報道認(rèn)為，組合光比單色光更能促進試管苗生長，紅光和紅藍(lán)混合光能提高根系的誘導(dǎo)率，促使根系發(fā)育健壯[10]。然而，紅光與藍(lán)光配比比例對不同試管苗的作用效果不盡相同，因此，基因型不同的植物在不同發(fā)育階段對光質(zhì)的需求不同。

CONTANS(CO)是植物光周期途徑中的核心調(diào)控因子，是植物特有的多基因家族，在植物接收、傳導(dǎo)光信號的過程中，與植物其他光信號調(diào)控蛋白相互作用，以此調(diào)控植物一系列生理過程[11]。CO和CO-Like(COL)基因具有N端鋅指結(jié)構(gòu)B-box和C端CCT保守結(jié)構(gòu)域，這2個結(jié)構(gòu)對CO基因的功能具有重要作用[12]。在許多植物中發(fā)現(xiàn)了COL基因，擬南芥(Arabidopsisthaliana)有17個COL基因[13]，水稻(Oryzasativa)有16個[14]，番茄(LycopersiconesculentumMill.)中至少有4個基因[15]，而葡萄(VitisviniferaL.)中至少有14個推測的CO基因[16]。CO及COL在不同植物中的功能可能不同。在擬南芥中，COL1和COL2基因?qū)﹂_花時間無顯著影響[17]；COL3抑制植物開花，正調(diào)控擬南芥光形態(tài)建成，促進側(cè)根發(fā)育和芽的分化[18]；COL4受ABA和鹽脅迫的調(diào)節(jié)，是植物忍受非生物逆境脅迫中的重要調(diào)節(jié)因子[13]；短日照條件下COL5促進植物開花[19]，而長日照條件下COL9抑制開花[20]。

綜上，目前CO基因家族的研究主要集中于如何應(yīng)對非生物脅迫和響應(yīng)光周期從而調(diào)控植物開花的機制中[16]，但CO基因家族對不同光質(zhì)及轉(zhuǎn)光條件的響應(yīng)未見報道。本研究克隆獲得葡萄光質(zhì)應(yīng)答相關(guān)的基因CO4(葡萄CO4的分子式為C1253H1990N32403402S11)，并對其進行生物信息學(xué)分析以及運用qRT-PCR技術(shù)分析其在不同光質(zhì)處理下的表達(dá)規(guī)律，為葡萄光質(zhì)改良提供候選基因，并為深入研究葡萄試管苗感光機理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為葡萄貝達(dá)(Vitisriparia×V.labrusca)試管苗，將其單芽莖段接種于GS[21]液體培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)于LED白光、紅光、藍(lán)光的人工氣候培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件為28 ℃，220 μmol/(m2·s)光照16 h；23 ℃暗培養(yǎng)8 h。

DH5α、AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher Scientific(上海)公司；pGEM-Teasy載體、T4DNA、LigBuffer、普通PCR SuperMix購自TaKaRa(大連)公司；Marker V購自TransGen Biotech(北京)公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理 將在GS液體培養(yǎng)基中生長的貝達(dá)試管苗放置于不同光質(zhì)及不同轉(zhuǎn)光條件下處理(表1)，35 d后用便攜式調(diào)制熒光儀(PAM-2100)在黑暗條件下測定試管苗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，試管苗葉片總RNA的提取使用CTAB法[22]。

表1 不同光質(zhì)和轉(zhuǎn)光培養(yǎng)條件Tab.1 Treatment conditions of grape plantlets under different light conversion

1.2.2 基因克隆 PCR MIX、大腸桿菌菌株、pEASY-T1 Cloning Kit均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，DL2000 Marker、DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司(北京)，熒光定量染料、SYBR Premix Ex Taq kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連 TaKaRa 公司。由上海生工生物工程股份有限公司進行引物的合成及測序。

葡萄CO4基因擴增上游引物：5′-GCGGATCCATGGTAATTTTGTGTTTGTTATTAC-3′；下游引物：5′-GCGAGCTCAGTTACCTGACATA-3′。PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸100 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，與克隆載體pGEM-Teasy連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，用X-gal和IPTG進行篩選，選取單一菌落進行PCR擴增檢測，將陽性克隆送上海生工測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 通過NCBI在線比對(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，篩選得到與其同源性較高的植物氨基酸序列，多序列比對用DNAMAN軟件完成，氨基酸序列同源性用Clustalx 1.83和MEGA 5.0軟件比較，然后用Maximum Likelihood法(參數(shù)為500)構(gòu)建進化樹。

氨基酸分子量、殘基的數(shù)目、理論等電點、不穩(wěn)定指數(shù)、脂溶指數(shù)以及親、疏水性用Expasy工具(http：//ca.expasy.org/tools.protscale.htm)進行分析。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測利用SOPMA(http：//www.predictprotein.org/)進行。蛋白質(zhì)跨膜域分析利用TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)進行。利用SignalP 4.1 server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽的分析。功能域分析使用InterPro：protein sequence analysis & classification(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/)進行。

1.2.4 葡萄CO4基因在不同處理下的表達(dá)水平分析CO4上游引物：5′-TCTGTGCCGCTCTACC-3′；下游引物：5′-GCTCAACCTCCATCCC-3′，以葡萄看家基因UBQ為內(nèi)參基因。用實時熒光定量儀(LightCycler?96，Roche)分析不同處理后葡萄CO4基因表達(dá)水平。PCR總體系25 μL：1 μL cDNA模板，上下游引物分別0.8 μL，SYBR Green 熒光染料12.5 μL，ddH2O 9.9 μL，反應(yīng)程序為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)。每處理設(shè)置3個重復(fù)，基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個處理設(shè)置3個重復(fù)，使用軟件SPSS 22.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，分析差異顯著性使用Duncan法，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄CO4基因的克隆

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的貝達(dá)葡萄試管苗的總RNA，結(jié)果表明，條帶完整無降解，其純度契合本試驗要求。以cDNA作為模板，設(shè)計特異性引物用于PCR擴增，得到與預(yù)期蛋白(663 bp)相符合的驗證序列。將陽性菌液作為模板，擴增出與目標(biāo)條帶大小一致的條帶(圖1)。測序結(jié)果與目標(biāo)基因序列一致，GenBank登錄號為KY652090。

M. DNA Marker V；A-1、B-1.空白對照；A.葡萄CO4的目的條帶擴增帶；B.葡萄CO4的菌液PCR擴增帶。M.DNA Marker V；A-1，B-1.Blank control；A.Amplified target band of gene CO4；B.Bacteria PCR amplified band.

2.2 葡萄CO4基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 多序列比對及進化樹構(gòu)建 本試驗克隆得到1個葡萄CO4基因，開放閱讀框(Open reading frame，ORF)為747 bp，編碼248個氨基酸，包括1個起始密碼子ATG和1個終止子TGA(圖2)。

氨基酸序列同源性比對分析顯示(圖3)，葡萄CO4同其他物種相似度為76.11%，由高到低依次為可可樹(TheobromacacaoXP_007025812.1)為48.88%、棉花(GossypiumhirsutumL. KJB57663.1)為48.61%、山崳(EutremasalsugineumXP_006417372.1)同源性為48.59%、棗(ZiziphusjujubaMill. XP_015869465.1)為47.19%、大豆(GlycinemaxKHN00100.1)為39.34%、巨桉(EucalyptusgrandisXP_010052390.1)為38.70%、核桃(JuglansregiaAAY89231.1)為38.39%、油菜(BrassicanapusXP_013711185.1)為37.43%、木薯(ManihotesculentaOAY26084.1)為37.40%、醉蝶花(TarenayahasslerianaXP_010533861.1)為37.21%、擬南芥(ArabidopsisthalianaL. CAA39037.1)為37.16%、擬南芥(ArabidopsisthalianaL. NP_172592.1)為36.97%。磷酸化位點分析結(jié)果表明，葡萄CO4基因含有4個磷酸化位點，其中，1個酪氨酸磷酸化位點(Tyr21)，1個蘇氨酸磷酸化位點(Thr236)，2個絲氨酸磷酸化位點(Ser85、Ser241)。

方框標(biāo)注為起始密碼子ATG及終止密碼子TGA；其中D(天冬氨酸)和E(谷氨酸)為酸性氨基酸，K(賴氨酸)、R(精氨酸)和H(組氨酸)為堿性氨基酸，其余為中性氨基酸。The ATG start codon and TGA stop codon is marked in pane；Asp(D)and Glu(E)belong to acidic amino acids，Lys(K)，Arg(R)and His(H)are basic amino acids，and the rest of them are neutral amino acids.

方框標(biāo)注葡萄CO4蘇氨酸磷酸化位點(Thr236)和絲氨酸磷酸化位點(Ser241)。The CO4 threonine phosphorylation site(Thr236)and serine phosphorylation site(Ser241)were marked in pane.

將葡萄CO4蛋白氨基酸序列與其他12種植物中同源蛋白氨基酸序列進行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)葡萄CO4與巨桉(Eucalyptusgrandis)CO親緣關(guān)系最近，屬同一亞族(圖4)。

圖4 葡萄 CO4進化樹分析Fig.4 CO4 gene in grapevine phylogenetic tree analysis

2.2.2 葡萄CO4基因的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析 葡萄CO4編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要形式有α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈結(jié)構(gòu)，主要的二級結(jié)構(gòu)為α-螺旋和延伸鏈結(jié)構(gòu)，其次為無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(表2)。

信號肽與跨膜域預(yù)測結(jié)果表明，葡萄CO4為跨膜蛋白，有一個信號肽，并有4個跨膜區(qū)，分別在第28-50個氨基酸區(qū)、第60-79個氨基酸區(qū)、第145-167個氨基酸區(qū)和第177-199個氨基酸區(qū)。

葡萄CO4的分子式為C1253H1990N324O340S11，含量最高的氨基酸是亮氨酸Leu(12.1%)，含量最低的氨基酸是組氨酸His(1.2%)。葡萄CO4屬疏水性蛋白，其總平均疏水性為0.430；該蛋白有較好脂溶性，其脂溶指數(shù)為114.40。從蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性來看，葡萄CO4的不穩(wěn)定指數(shù)為43.17，屬于不穩(wěn)定蛋白(表3)。

表2 葡萄 CO4編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析Tab.2 Protein secondary structure comparative analysis of CO4 gene in grapevine %

表3 葡萄CO4的理化性質(zhì)分析Tab.3 Physical and chemical characterization of CO4 protein in grapevine

2.3 葡萄CO4在不同光處理下的表達(dá)分析

葡萄CO4在不同光處理下的定量表達(dá)水平顯示(圖5)，葡萄CO4能夠積極響應(yīng)不同光處理信號。在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理下其表達(dá)量最高，是白光(對照)的5.39倍，差異顯著(P<0.05)；在白光轉(zhuǎn)紅光及紅光轉(zhuǎn)白光條件下，基因表達(dá)量與對照無顯著差異(P>0.05)；在白光轉(zhuǎn)藍(lán)光和藍(lán)光轉(zhuǎn)白光的處理下其表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，分別為對照的54%和68%。在紅光和藍(lán)光的處理下，葡萄CO4的相對表達(dá)量顯著(P<0.05)高于對照，其中在藍(lán)光處理下表達(dá)量最高，為對照的2.86倍。

上述結(jié)果表明，葡萄CO4在不同光質(zhì)及轉(zhuǎn)光條件下的響應(yīng)不同，其中在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理下表達(dá)量上調(diào)最顯著，藍(lán)光處理次之，白光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理下其表達(dá)量顯著下調(diào)。

2.4 不同光照處理對貝達(dá)葡萄試管苗葉片熒光參數(shù)的影響

葡萄試管苗葉片熒光參數(shù)在不同光質(zhì)及轉(zhuǎn)光處理下不同，在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理后Fv/Fm最高，差異顯著(P<0.05)；其次為白光；藍(lán)光及藍(lán)光轉(zhuǎn)白光處理下的Fv/Fm與對照差異不顯著(P>0.05)；在紅光處理下Fv/Fm最低，且差異顯著(P<0.05)(圖6-A)。Fv/Fo在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理后最高，其次為紅光處理，而在藍(lán)光、白光轉(zhuǎn)紅光、白光轉(zhuǎn)藍(lán)光、藍(lán)光轉(zhuǎn)白光處理后Fv/Fo均與對照差異不顯著(P>0.05)(圖6-B)。qP在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理后最高，在紅光轉(zhuǎn)白光、藍(lán)光轉(zhuǎn)白光處理后與對照均無顯著性差異(P>0.05)，在紅光處理后最低，是對照的54%(圖6-C)。紅光處理后NPQ顯著高于對照(P<0.05)，為對照4.83倍；紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理后NPQ最低，但與對照無顯著差異(P>0.05)(圖6-D)。

圖中不同小寫字母表示在5%水平上差異顯著(P<0.05)。圖6同。Different small letters in the figure meant significant difference at 0.05 levels among treatments. The same as Fig.6.

圖6不同處理對熒光參數(shù)的影響Fig.6 Effect of different treatments on chlorophyll fluorescence parameters

3 討論

CO基因?qū)χ参锕庵芷谛盘杺鲗?dǎo)具有重要作用，CO蛋白能夠?qū)⑸镧娦盘柡凸庑盘栂嗾希⑼ㄟ^誘導(dǎo)FLOWERING LOCUS T(FT)和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1(SOC1)的表達(dá)，進而促使植物開花[23]；CO基因還在芽休眠、株高伸長、側(cè)枝(根)分化、果實成熟、光形態(tài)建成、生物和非生物脅迫抗性、塊莖發(fā)育等過程中起著重要作用[17，24]。有研究認(rèn)為，多數(shù)真核生物的磷酸化過程主要在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基中進行，而Ser85是向光素1的磷酸化位點，向光素接收光信號后，可以通過自發(fā)磷酸化作用輸出光信號[25]。本研究中，克隆到的葡萄CO4基因含有2個絲氨酸磷酸化位點(Ser85和Ser241)，1個蘇氨酸磷酸化位點(Thr236)，1個酪氨酸磷酸化位點(Tyr21)，推測葡萄CO4能夠通過磷酸化反應(yīng)對不同光照條件進行感知和應(yīng)答，從而調(diào)控植物的生長發(fā)育。

CO基因的表達(dá)受光質(zhì)調(diào)控，光敏色素能通過影響CO基因編碼蛋白的穩(wěn)定性，以此調(diào)控CO基因的表達(dá)模式[18]。Imaizumi等[26]研究認(rèn)為，CO基因轉(zhuǎn)錄水平受光照控制，藍(lán)光受體基因FKF1在藍(lán)光刺激下通過降解CDF1的活性而促進CO基因的轉(zhuǎn)錄。樊麗娜等[27]認(rèn)為，CO蛋白在紅光下不穩(wěn)定，在藍(lán)光下穩(wěn)定。本研究中，CO4在葡萄轉(zhuǎn)光培養(yǎng)中響應(yīng)敏感，紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光后葡萄CO4基因表達(dá)量顯著上調(diào)；在單色光紅光和藍(lán)光處理下，葡萄CO4表達(dá)量均高于白光，因此，藍(lán)光和紅光對誘導(dǎo)葡萄CO4的表達(dá)具有促進作用。Sawa等[28]也認(rèn)為，藍(lán)光能夠促進擬南芥CO基因轉(zhuǎn)錄，與本研究結(jié)果相近。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)值的變動能夠反映植物的一系列光合生理特性，因此，可用來評估植物的光合能力；光質(zhì)是葉綠素?zé)晒鈪?shù)的一個重要影響因素，有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物的光合速率在紅光下高于藍(lán)光[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、Fv/Fo、qP在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理后均高于其他處理，NPQ在該處理下最低；藍(lán)光處理后的Fv/Fm、qP顯著高于紅光處理，推測紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光能夠提高貝達(dá)葡萄試管苗葉片PSⅡ的原初光能轉(zhuǎn)換效率；藍(lán)光比紅光更能促進試管苗對光能的利用，且在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理后促進作用更為明顯。Bondada等[29]認(rèn)為，藍(lán)光促進葉綠體的形成，紅光主要促進光合產(chǎn)物的累積，這可能與藍(lán)光能夠促進光基因psbA轉(zhuǎn)錄物質(zhì)的積累有關(guān)，張文林等[30]對轉(zhuǎn)基因楊樹的研究中也認(rèn)為，藍(lán)光能夠提高PS Ⅱ的相對電子傳遞速率。此外，葡萄CO4表達(dá)水平、Fv/Fm、Fv/Fo、qP在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理后均分別高于紅光和藍(lán)光處理，且在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理與藍(lán)光轉(zhuǎn)紅光處理之間差異顯著。據(jù)報道，光敏色素或光受體誘導(dǎo)的反應(yīng)發(fā)生于植物生長發(fā)育的一定時期和一定組織中，具有一定的時空效應(yīng)[31]。由此推測，紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理與藍(lán)光轉(zhuǎn)紅光處理間的差異是因為紅光和藍(lán)光的光效應(yīng)具有時間順序差異，導(dǎo)致光能在植物光合系統(tǒng)中分布不平衡，但其中的作用機理尚未見報道，有待進一步研究。

本研究利用RT-PCR法克隆得到葡萄CO4基因，發(fā)現(xiàn)該基因受不同光質(zhì)調(diào)節(jié)，在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光條件下，相對表達(dá)水平顯著高于對照；同時，該光照條件可提高葡萄試管苗對光能的利用。在后期研究中，將對該基因所關(guān)聯(lián)的下游元件做深入分析，以期闡明葡萄CO4及其調(diào)控系統(tǒng)對光合信號的響應(yīng)，為深入研究葡萄試管苗CO基因感光機理及對光質(zhì)改良提供依據(jù)。