張俊環(huán)，孫浩元，Boris Kr?ka，楊 麗，姜鳳超，張美玲，王玉柱

(1. 北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院，北京 100093；2.孟德爾大學(xué) 園藝學(xué)院，布爾諾 69144)

李痘病毒(Plumpoxvirus，PPV)病是桃、杏、李、櫻桃等核果類果樹最危險(xiǎn)的病害之一。PPV侵染后，葉片和果實(shí)表現(xiàn)出明顯癥狀，葉片出現(xiàn)褪綠壞死斑，果實(shí)出現(xiàn)環(huán)斑或嚴(yán)重變形并在成熟前落果，嚴(yán)重時(shí)則全樹死亡，引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，在易感品種中損失可高達(dá)80%[1-2]。PPV病最先于1915年在保加利亞發(fā)現(xiàn)，之后在整個(gè)歐美地區(qū)廣泛流行，嚴(yán)重限制了歐美地區(qū)核果類果樹的發(fā)展[3-4]，2009年日本也發(fā)現(xiàn)了PPV的發(fā)生[5]。李痘病毒可經(jīng)蚜蟲傳播，擴(kuò)散速度快，在短時(shí)間內(nèi)即可能給全國整個(gè)核果類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來災(zāi)難性后果。病害的嚴(yán)重性在很大程度上取決于寄主是感病還是耐病品種，因此，國外核果類果樹學(xué)者一直致力于抗PPV品種的選育研究，2007年歐盟國家啟動(dòng)了杏的抗PPV育種計(jì)劃(FP7-KBBE-2007-1)，在分子輔助育種方面做了大量研究，主要是進(jìn)行抗PPV連鎖標(biāo)記的篩選。2002年，Hurtado等[6]抗/感分離群體構(gòu)建杏遺傳圖譜，并最終將抗PPV連鎖標(biāo)記定位到了第一連鎖群的上端。2012年，Soriano等[7]將抗PPV基因的定位區(qū)間進(jìn)一步縮小，并篩選出3個(gè)SSR連鎖標(biāo)記，但后來Decroocq等[8]對這3個(gè)標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)并不能有效地用于輔助選擇。近期有研究報(bào)道通過高通量測序技術(shù)進(jìn)行杏、李、桃等核果類果樹PPV抗性基因的篩選[9-12]。但直到如今，仍尚未發(fā)現(xiàn)能夠有效控制PPV的措施；一旦果樹感病，只能立即砍樹，進(jìn)行清園處理。

目前，中國還沒有發(fā)現(xiàn)核果類果樹感染PPV的報(bào)道，但不能完全保證無帶毒植株的存在，因?yàn)镻PV與李屬壞死環(huán)斑病毒等所引起的癥狀十分相似，并且感病初期植株的表型癥狀不明顯，很難用肉眼觀察區(qū)分[13]。另一方面，這也表明了我國本土的杏、李資源或許存在抗PPV基因，國外鑒定的杏抗PPV品種的抗性基因多來源于中國杏品種資源[14]。抑或是病毒還沒有傳播進(jìn)我國的杏、李產(chǎn)區(qū)，但是，隨著近些年國內(nèi)外資源的頻繁交流，每年從國外輸入中國的李屬果樹砧木、果實(shí)及種子的數(shù)量較大，其中不能完全排除攜帶PPV的可能。由于種子、砧木等植物材料中PPV濃度很低，檢測難度較大，容易出現(xiàn)漏檢和假陰性的情況，導(dǎo)致PPV傳入的可能性較大，同時(shí)有些引進(jìn)品種是PPV易感材料，如從國外引進(jìn)的易于扦插生根的杏砧木Myrabalan，增加了PPV傳入的風(fēng)險(xiǎn)。由此可見，我國現(xiàn)已處于PPV傳播或感染的危險(xiǎn)境地。因此，一方面迫切需要建立起特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速高效的檢測技術(shù)，以有效防止PPV的入侵，控制PPV這一病毒在我國杏、李產(chǎn)區(qū)的流行發(fā)展；另一方面需要利用已有的優(yōu)勢資源，著手尋找抗PPV資源。本研究在比較確定杏樹PPV病毒感染的分子快速鑒定方法的同時(shí)，利用捷克孟德爾大學(xué)園藝學(xué)院Boris教授構(gòu)建的杏PPV抗性分離的F1群體，篩選與PPV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，并進(jìn)一步篩選我國杏資源中存在的PPV抗性材料，以期為抗PPV基因的挖掘研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以抗PPV的2個(gè)杏品種Harlayne和Betinka[15]為親本材料進(jìn)行雜交，獲得PPV抗性分離的F1群體。2015年4月在杏樹展葉期從捷克孟德爾大學(xué)的杏園采集F1群體及其親本的葉片，從北京林業(yè)果樹科學(xué)研究院杏、李資源圃采集新鮮的杏、李資源(表1)的嫩葉，液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取

按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)的方法提取葉片材料的總RNA。試劑盒(Cat.# DP441)購自天根生化科技(北京)有限公司。

表1 供試的杏、李品種Tab.1 Cultivarnames of tested materials including apricot plum

注：1～8為引進(jìn)的杏和李資源；9～53為國內(nèi)杏品種。

Note：1-8 were introduced cultivars of apricot or plum；9-53 were domestic apricot cultivars.

1.3 RT-PCR法檢測PPV

cDNA的制備：以總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照Thermo_Scientic Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒的說明進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄體系為45 μL。

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽性對照為攜帶PPV病毒基因的質(zhì)粒(由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所李世訪研究員實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))。擴(kuò)增體系為20 μL：10×Buffer 2 μL、25 mmol/L Mg2+1.6 μL、10 mmol/L dNTP 0.4 μL、上下游引物各0.4 μL、模板cDNA 1 μL和0.5 U/μLTaq酶0.2 μL，ddH2O 14 μL。PPV基因的擴(kuò)增引物序列為F：5′-CAGACTACAGCCTCGCCAGA-3′，R：5′-ACCGAGACCACTACACTCCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為243 bp[16]。RT-PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，然后以94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)程序在MyCyclerTMthermal cycler(Bio-Rad Laboratories，Inc.，USA)PCR儀上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在凝膠分析系統(tǒng)下觀察、照相。

1.4 熒光定量法檢測PPV

采用伯樂的SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)試劑盒，實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR反應(yīng)體系為10 μL體系：2×Premix 5 μL、PPV通用引物(同1.3)各1 μL、ddH2O 2 μL、cDNA模板1 μL，以杏Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，其引物序列為F：5′-ACATTGTTCTTAGTGGTGGGTC-3′，R：5′-AGATTCGTCATACTCTGCCTTT-3′[17]。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，均以ddH2O作為模板的空白對照。用Bio-Rad CFX 96TM熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s，55 ℃退火15 s，65 ℃延伸5 s，循環(huán)39次。循環(huán)后設(shè)置在55～95 ℃每提高1 ℃時(shí)讀取熒光值并生成溶解曲線。基因相對表達(dá)量的計(jì)算，參考Livak等[18]的方法，以2-ΔΔCT表示，ΔΔCT=樣本CT值的平均數(shù)-內(nèi)參CT值的平均值。

1.5 DNA提取

按照高效植物基因組DNA提取試劑盒(Cat.# DP350)的方法提取葉片材料的總DNA。試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.6 抗PPV對等基因池的建立

采用BSA(Bulked Segregation Analysis)法，即根據(jù)F1性狀鑒定的結(jié)果，將雜交群體分成2組，1個(gè)高抗組，1個(gè)易感組，每組5株，將這2組的DNA分別進(jìn)行等量混合，組成對等基因池。

1.7 SSR分析

SSR-PCR反應(yīng)體系參照Zhang等[19]的方法。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，然后置于4 ℃待電泳檢測。選用的SSR引物是已經(jīng)利用杏材料篩選出的多態(tài)性較好的引物，包括Decroocq等[8]研究中抗PPV基因QTL定位區(qū)間的SSR位點(diǎn)。所有擴(kuò)增產(chǎn)物采用0.6%聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染法檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏樹感染PPV快速檢測方法的建立

2.1.1 RNA提取 對從捷克采回的2份感病杏葉片材料(C-1、C-2)和資源圃的8份引進(jìn)資源材料(2-1、25-26、25-29、25-32、25-35、25-39、23-38、157/3S)進(jìn)行了總RNA的提取以及RNA質(zhì)量和濃度的檢測。如圖1所示，提取的總RNA中，基因組DNA已完全去除，而且28S和18S核糖體RNA條帶非常明顯；RNA質(zhì)量和濃度的檢測結(jié)果顯示，所有樣品的RNA濃度在86～220 ng/μL，OD260/280比值介于1.8～2.1，能夠滿足后續(xù)RT-PCR和熒光定量PCR試驗(yàn)的要求。

M.Marker；泳道1～10對應(yīng)的杏樣品編號：2-1、25-26、25-29、25-32、25-35、25-39、23-38、157/3S、C-1、C-2。M.Marker；The numbers of apricot samples in the lanes 1-10 were 2-1，25-26，25-29，25-32，25-35，25-39，23-38，157/3S，C-1，C-2.

2.1.2 RT-PCR快速檢測PPV 在優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，篩查引進(jìn)的8份杏資源材料是否感染PPV。從圖2可知，這8份引進(jìn)材料均未擴(kuò)增出目的條帶(243 bp)，只有陽性對照樣品擴(kuò)出了此條帶。表明8個(gè)引進(jìn)的杏樣品均不攜帶PPV。

M.Marker；泳道1～8對應(yīng)的杏樣品編號：2-1、25-26、25-29、25-32、25-35、25-39、23-38、157/3S；PC.陽性對照；NC.陰性對照。M.Marker；The numbers of apricot samples in the lanes 1-8 were 2-1，25-26，25-29，25-32，25-35，25-39，23-38，157/3S；PC.Positive control；NC.Negative control.

2.1.3 qRT-PCR熒光定量分析 為了進(jìn)一步檢驗(yàn)RT-PCR方法的可靠性和材料是否帶毒的確定性，對8份材料和2份已知感病的對照材料進(jìn)行了高特異、高敏感性的熒光定量PCR分析。由圖3-A、B可知，內(nèi)參基因和目的基因的指數(shù)擴(kuò)增期和平臺期均十分明顯，而且內(nèi)參基因和目的基因的溶解曲線均呈單峰型，證明擴(kuò)增的特異性較好?？梢愿鶕?jù)樣品的CT值計(jì)算出目的基因的相對表達(dá)量。由圖3-C可以看出，8個(gè)杏樣本中均未檢測出PPV基因的表達(dá)，而在對照的2個(gè)帶毒樣本C-1和C-2中，這一基因的相對表達(dá)量高達(dá)58 734.39和184 478.25。熒光定量檢測結(jié)果與2.1建立的RT-PCR快速檢測方法對8個(gè)杏樣本的檢測結(jié)果完全一致，證明了所建立的RT-PCR快速檢測體系是高效、可靠的。

A.基因擴(kuò)增曲線；B.溶解曲線；C.PVV基因相對表達(dá)量；ND.未檢測到。A.Amplification plot；B.Melt curve plot；C.Relative expression of PVV gene; ND.No detected.

2.2 群體表型性狀的鑒定和取樣

2013年7月捷克孟德爾大學(xué)園藝學(xué)院Boris實(shí)驗(yàn)室利用2個(gè)抗PPV的杏品種Harlayne和Betinka作親本進(jìn)行雜交，獲得了近200株的F1分離群體。2014年對群體單株的抗病性進(jìn)行生物學(xué)鑒定。2015年7月從捷克采回F1分離群體的葉片樣品100份，包括34份抗病個(gè)體、34份易感個(gè)體和32份耐病個(gè)體。

2.3 PPV抗/感性狀連鎖標(biāo)記的篩選

2.3.1 群體DNA樣本的制備 對100份F1分離群體及其2個(gè)親本的樣本基因組DNA進(jìn)行提取與DNA質(zhì)量和濃度檢測，全部樣品的OD260/280在1.8～2.0，樣品的濃度均大于100 ng/μL，總量均大于10 μg；DNA電泳結(jié)果顯示：所有樣品主帶清晰，樣品無RNA污染，個(gè)別樣品有蛋白質(zhì)污染，但不影響后續(xù)試驗(yàn)；因此，樣品的純度、濃度與總量均能較好地保證后續(xù)的SSR分子標(biāo)記試驗(yàn)。圖4顯示了部分樣品的DNA瓊脂糖電泳結(jié)果。

2.3.2 SSR引物的親本間篩選以及在抗病/感病對等基因池間的篩選 用11對SSR引物同時(shí)在親本Betinka和Harlayne，以及抗病混合池和感病混合池間之間進(jìn)行篩選，所有的引物均能夠擴(kuò)增出清晰條帶，占總引物數(shù)的100%，其中有6對引物能夠同時(shí)在親本間以及抗病混合池和感病混合池間擴(kuò)增出相同的差異條帶，占總引物數(shù)的54.5%，這6條多態(tài)性引物序列見表2。圖5顯示了11對引物在兩親本間以及抗病/感病混合池間的擴(kuò)增結(jié)果。

圖4 部分F1個(gè)體的DNA提取結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoresis of DNA samplesextracted from F1 population inapricot

表2 親本和對等基因池間多態(tài)性一致的引物Tab.2 The polymorphic primers between two parents and two DNA bulks

11對引物分別為PGS1.24、PGS1.23、PGS1.21、PaCTA17、Pchcms4、UDP96-005、PaCITA5、UDA-025、UDAp-414、Pchgms4和CPPCT27；相鄰的4個(gè)泳道是一對引物；篩選樣品分別為抗病基因池、感病基因池、抗性親本Betinka和易感親本Harlayne。The eleven pairs of primers including PGS1.24，PGS1.23，PGS1.21，PaCTA17，Pchcms4，UDP96-005，PaCITA5，UDA-025，UDAp-414，Pchgms4 and CPPCT27；The primers in adjacent four lanes were the same；The samples for screening were resistance gene pool，susceptible gene pool，resistance parent Betinka and susceptible parent Harlayne，respectively.圖5 11對引物在2個(gè)對等基因池間和2個(gè)親本間的擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 The profile of 11 SSR loci amplification in the two parents and two DNA bulks

2.3.3 抗病/感病對等基因池間多態(tài)性引物在部分分離群體間的復(fù)選 用對等基因池和親本間相同的多態(tài)性引物繼續(xù)在親本和46個(gè)分離群體間進(jìn)行復(fù)選，46個(gè)分離群體根據(jù)表型(PPV抗性)不同分為3組：抗病群體(R)、耐病群體(T)和易感群體(S)，3類群體分別選用的后代個(gè)體數(shù)量為16，12，18個(gè)。結(jié)果如圖6所示，6對引物中只有1對引物(PGS1.23)在后代的分離群體中擴(kuò)增出有規(guī)律的多態(tài)性條帶。在PGS1.23擴(kuò)增出的差異帶中，條帶a在大多易感后代和親本Betinka中出現(xiàn)，而在F1群體的大多數(shù)抗性個(gè)體(R)中未出現(xiàn)，說明該條帶可能與易感性狀相關(guān)；條帶b抗性后代和抗性親本Harlayne中出現(xiàn)，而在多數(shù)易感后代中沒有出現(xiàn)，說明該條帶可能與杏的PPV抗性性狀有連鎖。

2.3.4 連鎖標(biāo)記在分離群體的驗(yàn)證 在F1分離的極端群體(易感和高抗)和兩親本間對篩選出的連鎖標(biāo)記PGS1.23進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見圖7。PGS1.23在19個(gè)易感后代(S1～S19)中有15個(gè)擴(kuò)增出了片段a，在18個(gè)高抗(R1～R18)后代中有14個(gè)擴(kuò)增出了片段b，此標(biāo)記檢測分離群體PPV抗性的符合度達(dá)到了78.3%，基本可用于PPV抗性的輔助選擇。PPV抗性是一個(gè)多基因控制的性狀，今后還需要進(jìn)一步尋找其他連鎖程度更高的分子標(biāo)記，以更好地應(yīng)用于PPV抗性育種過程中的早期輔助選擇。

M.Marker；S1～S19.PPV易感個(gè)體；T1～T12.PPV耐病個(gè)體；R1～R18.PPV抗性個(gè)體；B.Betinka；H.Harlayne；a和b是特異條帶。圖7同。M.Marker；S1-S19.PPV-susceptible progeny；T1-T12.PPV-tolerant progeny；R1-R18.PPV-resistant progeny；B.Betinka；H.Harlayne；a，b.The special bands.The same as Fig.7.

圖7 連鎖標(biāo)記PGS1.23在易感抗病F1群體和親本間的擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 The amplification profile of the linkage marker PGS1.23intwo parents and F 1 individuals

2.4 抗PPV資源的篩選

利用篩選到的連鎖標(biāo)記對本課題組資源圃保存的杏資源進(jìn)行PPV高抗資源的篩選，以期建立我國抗PPV的杏資源名錄。如圖8所示，菜籽黃、楊繼元、垂枝山杏、大早熟和媳婦杏具有抗性品種Harlayne和Betinka的擴(kuò)增片段b，其中菜籽黃、楊繼元、媳婦杏與Harlayne的擴(kuò)增結(jié)果基本一致。篩選出的抗PPV資源，為進(jìn)一步挖掘抗PPV的基因提供了材料基礎(chǔ)，也可作為親本用于抗PPV品種的選育研究。

圖8 連鎖標(biāo)記PGS1 23對45份中國杏資源和2個(gè)參照品種Betinka和Harlayne的擴(kuò)增結(jié)果Fig.8 The profile of SSR amplification of the linkage marker PGS1.23in45Chinaapricotcultivarsandtwo control cultivars Betinka and Harlayne

3 討論

目前檢測PPV的常用方法有酶聯(lián)免疫ELISA、普通RT-PCR、多重PCR以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)等。相對于ELISA方法，PCR方法更加高效和靈敏。Wetzel等[16]于1991年建立了普通RT-PCR檢測PPV的方法，根據(jù)病毒基因序列設(shè)計(jì)出引物，用此引物在感染PPV的材料中均能檢測到243 bp的擴(kuò)增片段，后來PPV的PCR檢測方法中均以是否擴(kuò)增出這一特異的片段為判斷標(biāo)準(zhǔn)[20]。本研究結(jié)果表明：熒光定量PCR和普通RT-PCR方法均能快速、準(zhǔn)確地檢測PPV病毒是否存在，但普通的RT-PCR檢測方法更加簡單，成本相對較低，所以可優(yōu)先選用RT-PCR方法對杏、李等核果類果樹PPV病毒病進(jìn)行快速檢測。通常使用的植物材料、試劑及設(shè)備不同時(shí)，所用的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件也有所不同。本研究針對杏葉片材料和所使用的試劑盒材料，建立了杏的PPV快速檢測RT-PCR反應(yīng)體系。建立PPV的快速檢測技術(shù)體系，可對已收集與保存的杏、李資源進(jìn)行PPV抗性評價(jià)，也可對從歐美PPV高發(fā)地區(qū)引進(jìn)的櫻桃和桃等核果類果樹資源進(jìn)行擴(kuò)展檢測，為控制PPV病毒在我國的發(fā)生與傳播提供一定的技術(shù)支撐。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合BSA法是篩選與目的基因緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記的一個(gè)有效方法。在果樹和作物上，通過此方案已經(jīng)對許多控制重要農(nóng)藝性狀的基因進(jìn)行了標(biāo)記的篩選[21-23]。本研究利用此方法，對已經(jīng)發(fā)表的PPV抗性基因定位區(qū)間內(nèi)的多個(gè)SSR標(biāo)記在PPV抗性分離群體中進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記PGS1.23與抗PPV基因連鎖程度最高，檢測分離群體PPV抗性的符合度達(dá)到了78.3%。而Decroocq等[8]用PGS1.23在多個(gè)歐洲品種材料上都沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，這可能與試驗(yàn)材料和條件有關(guān)。獲得與抗PPV基因緊密連鎖分子標(biāo)記PGS1.23，一方面，可用于抗PPV育種的早期輔助選擇，在苗期進(jìn)行抗病株系的篩選，可有效節(jié)約人力、土地資源，并加快抗病育種進(jìn)程；另一方面，可用來在我國本土杏、李資源中尋找抗PPV的重要材料。目前，我國杏、李主產(chǎn)區(qū)尚未發(fā)生過PPV病毒病的爆發(fā)流行，由此可認(rèn)為我國本土的資源中也許存在抗病性材料，所以利用建立起來的檢測技術(shù)和抗PPV連鎖標(biāo)記對資源圃現(xiàn)有的杏、李資源進(jìn)行PPV抗性評價(jià)，初步篩選出了5份抗PPV的杏品種資源，可為抗PPV育種提供較好的親本材料，也為進(jìn)一步對抗PPV基因的挖掘研究奠定了基礎(chǔ)。