王慧飛，馮 雪，張一名，馮立峰，張 瑜，陳 光，孫艷香

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.廊坊師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北 廊坊 065000；3.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)學(xué)院，河北 廊坊 065000)

精氨酸(L-Arg)是植物體內(nèi)N/C最高(4/6)的氨基酸，除作為氮素的主要儲(chǔ)存物質(zhì)外，也是重要信號(hào)分子如一氧化氮(Nitric oxide，NO)、多胺(Polyamines，PAs)等生物合成前體，在器官生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)多種脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[1]。生物體內(nèi)主要存在3種L-Arg的分解途徑：在精氨酸脫羧酶(Arginine decarboxylas，ADC，EC 4.1.1.17)作用下逐步形成鯡精胺、腐胺，進(jìn)而合成PAs；或在一氧化氮合酶(Nitric oxide synthases，NOS，EC 1.14.13.39)催化生成瓜氨酸(L-Cit)和NO，從而形成L-Cit-NO循環(huán)；或在精氨酸酶(Arginase，ARG，EC 3.5.3.1)作用下，生成鳥(niǎo)氨酸和尿素，參與尿素循環(huán)[2]。由于這3個(gè)分解途徑競(jìng)爭(zhēng)相同的底物，一般在動(dòng)物學(xué)研究中認(rèn)為，ARG作為“門(mén)控開(kāi)關(guān)”，調(diào)節(jié)L-Arg經(jīng)ADC途徑向PAs的代謝或經(jīng)NOS途徑向NO的合成以適應(yīng)生理和環(huán)境的變化[3]。在植物中對(duì)ARG功能的研究還未得到一致的結(jié)果。

較早被證實(shí)，植物中存在ARG活性的物種是鳶尾(Irisbulbs)和花生(ArachishypogeaL.)，顯示其為Mn2+依賴(lài)的金屬酶，定位于線粒體[4-5]。1995年Krumpelman等[6]首次在酵母中表達(dá)了擬南芥(Arabidopsisthaliana)ARG基因，后陸續(xù)從大豆(GlycinemaxL.)[7]、火炬樹(shù)(PinustaedaL.)[8]、水稻(OryzasativaL.)[9]、玉米(ZeamaysL.)[10]等多種植物中分離出其cDNA序列，證明其在基因組以多拷貝小基因家族形式存在。家族成員之間表達(dá)上不僅存在時(shí)空差異，也存在信號(hào)分子的特異性響應(yīng)。如在擬南芥和番茄中分別存在2個(gè)ARG基因序列[11-13]，擬南芥ARGAH1在花粉中表達(dá)，而ARGAH2則沒(méi)有表達(dá)，茉莉酸甲酯(MeJA)可以誘導(dǎo)ARGAH2，而對(duì)ARGAH1無(wú)影響[11-12]；番茄LeARG1和LeARG2在花蕾、成熟花苞和花，以及未成熟的果實(shí)等生殖組織中大量表達(dá)，而在葉片和莖中沒(méi)有表達(dá)，只有LeARG1在根中表達(dá)，且只有LeARG2響應(yīng)MeJA 的誘導(dǎo)[13]。此外，F(xiàn)lores等[14]發(fā)現(xiàn)，擬南芥中ARGAH基因的T-DNA插入突變體未見(jiàn)表型缺陷，其體內(nèi)ARGAH的活性與NO的累積負(fù)相關(guān)；Shi等[15]證實(shí)，擬南芥突變體argah1、argah2以及argah1argah2中因有較高的NO和PAs含量而提高了抗旱、耐鹽和耐低溫能力[14-15]。水稻OsARG的突變嚴(yán)重影響了植株的生長(zhǎng)和結(jié)實(shí)，而超表達(dá)OsARG的轉(zhuǎn)基因水稻在氮供應(yīng)受限條件下具有較高的谷粒數(shù)目和產(chǎn)量[16]；此外，過(guò)表達(dá)的OsARG改變了轉(zhuǎn)基因棉花葉片中多種氨基酸的含量，氮素轉(zhuǎn)換發(fā)生影響，表現(xiàn)為地上部NO含量下降，田間條件下植株體內(nèi)腐胺含量增高；從形態(tài)學(xué)角度，過(guò)表達(dá)的OsARG使得轉(zhuǎn)基因棉花主根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)目與長(zhǎng)度發(fā)生改變，同時(shí)增加了纖維的長(zhǎng)度[17]。這些已有的研究顯示，精氨酸酶在植物氮素利用、生長(zhǎng)發(fā)育等方面具有重要作用。然而，到目前為止，還較少見(jiàn)棉花內(nèi)源精氨酸酶調(diào)控及功能鑒定的報(bào)道。

筆者克隆了棉花體內(nèi)一條精氨酸酶基因的cDNA序列，分析NaCl和PEG脅迫，脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)、MeJA等信號(hào)分子對(duì)其表達(dá)的影響，并利用大腸桿菌體外表達(dá)技術(shù)檢測(cè)了其編碼產(chǎn)物活性，以期為更深入了解該基因在棉花中的調(diào)控規(guī)律和生物學(xué)功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

陸地棉(GossypiumhirsutumLinn.)種子由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花育種組提供。將去纖維的、大小均一、成熟飽滿的籽粒，消毒后置于含有適量滅菌水的無(wú)菌試管中，暗培養(yǎng)至胚根全部長(zhǎng)出后，取胚根提取總RNA，用于基因克隆。另一組種子播種于營(yíng)養(yǎng)土中，每天光照培養(yǎng)16 h，溫度為(25±1)℃，培養(yǎng)至兩葉一心、選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗分別進(jìn)行不同脅迫，NaCl濃度200 mmol/L，PEG6000濃度20%，ABA濃度100 μmol/L，SA濃度5 mmol/L，MeJA濃度100 μmol/L。鹽溶液采用營(yíng)養(yǎng)缽底部吸收的方法至營(yíng)養(yǎng)土飽和；PEG溶液釋放于營(yíng)養(yǎng)缽底部托盤(pán)中；激素用噴壺噴施至葉片滴水為止，MeJA以4%乙醇溶液做對(duì)照，其余以ddH2O作對(duì)照。取幼嫩頂端真葉清洗干凈，液氮速凍后-80 ℃保存，作為分析基因特異性表達(dá)的研究材料。

1.2 棉花GhARG1基因的克隆與生物信息學(xué)分析

以擬南芥ARGcDNA序列(NM 116959.3)作為探針，利用NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)獲得棉花EST序列信息，通過(guò)Blast分析和DNAMAN 6.0電子拼接得cDNA序列。用 Primer Premier 5.0 在cDNA 序列的 5′和 3′端設(shè)計(jì)上下游一對(duì)引物用于擴(kuò)增開(kāi)放閱讀框(ORF)片段(表1)。以植物RNA快速提取試劑盒(北京艾德萊)提供的方法提取胚根總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。將目的片段純化，回收，與T/A克隆載體pGSI-T(中美泰和)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，在含有50 mg/L氨芐青霉素鈉(Amp)LB平板上抗性篩選，挑取菌落轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，測(cè)序。運(yùn)用 DNAMAN 6.0 軟件對(duì)測(cè)序信息進(jìn)行初步分析，cDNA 序列的翻譯和比對(duì)分析，測(cè)序確定的序列定名為GhARG1。利用NCBI的ORF Finder推測(cè)開(kāi)放閱讀框架，利用Blast和Clustal O(1.2.4)進(jìn)行蛋白序列的多重序列對(duì)比和同源性分析； ExPASy在線服務(wù)器分析GhARG1蛋白的分子量、等電點(diǎn)、疏水性等。利用Phyre2在線分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域，并構(gòu)建GhARG1蛋白的三維結(jié)構(gòu)；利用SignalP 4.1 Server在線分析信號(hào)肽序列；利用MEGA 6.06 軟件的鄰接法對(duì)同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

表1 所用引物Tab. 1 Primers used

注：下劃線部分為酶切位點(diǎn)；加粗部分為保護(hù)堿基。

Note：The underlined part is the restriction sites；Bold part is protection base.

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR

用艾德萊公司EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒、DNase I 柱上消化試劑盒提取純化棉花葉片RNA，用第一條鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real time qPCR利用BIO-RAD 熒光定量PCR-IQ5進(jìn)行，定量分析GhARG1的相對(duì)表達(dá)。反應(yīng)體系(20 μL)及方法如下：TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL；ARG1qF(10 μmol/L)0.5 μL；ARG1qR(10 μmol/L)0.5 μL；模板(稀釋10倍的cDNA 溶液)1.0 μL；ddH2O 8.0 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性，95 ℃，1 min，1個(gè)循環(huán)；變性，95 ℃，15 s；退火/延伸 60 ℃，60 s，45個(gè)循環(huán)；融解曲線(Melting curve analysis 55～95 ℃)檢測(cè)，機(jī)器自動(dòng)設(shè)置；每個(gè)反應(yīng)均做3孔重復(fù)。采用 2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)[18]。

1.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建

以測(cè)序結(jié)果篩選出的陽(yáng)性質(zhì)粒pGSI-GhARG1為試驗(yàn)材料，重新設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引入KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，利用KpnⅠ和XbaⅠ(Thermo scientific公司)雙酶切PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)載體質(zhì)粒pCold-TF，用T4DNA 連接酶(大連寶生物公司)連接到同樣雙酶切的 pCold-TF(大連寶生物)大片段上，16 ℃連接2 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10中，在含有50 mg/LAmp的LB固體培養(yǎng)基抗性篩選培養(yǎng)12 h。挑取重組菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，測(cè)序，對(duì)構(gòu)建成功的原核表達(dá)質(zhì)粒命名為pCold-GhARG1。

1.5 基因工程菌制備與表達(dá)

將原核表達(dá)重組質(zhì)粒pCold-GhARG1和空載體pCold-TF采用熱激轉(zhuǎn)化法，分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株Transetta(DE3)大腸桿菌中(全式金)，在含Amp和34 mg/L 氯霉素(Cm)抗性的LB固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)，挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min，培養(yǎng)12 h后，2%接種擴(kuò)大培養(yǎng)，OD600達(dá)到0.6左右時(shí)，15 ℃冷激活30 min，IPTG(1 mmol/L)誘導(dǎo)培養(yǎng)36 h。離心收集菌體，菌體沉淀用100 μL的5×上樣緩沖液懸起后煮沸裂解，12 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，其中分離膠為12%，濃縮膠為5%，進(jìn)行電泳分析[19]。

1.6 原核表達(dá)產(chǎn)物的酶活檢測(cè)

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.05 g烘干后的菌體，加入1.5 mL 1 mol/L pH 值9.8 Tris緩沖液。采用凍融法破碎大腸桿菌，12 000 r/min離心5 min，去沉淀，取上清，按照1∶1加入飽和的硫酸銨，調(diào)pH值7.4左右，4 ℃沉淀1 h左右，12 000 r/min離心5 min，沉淀用800 μL pH值 9.8 Tris緩沖液溶解作為預(yù)處理的酶液；取200 μL酶液加入1.5 μL 1 mol/L MnCl2混勻，40 ℃溫育30 min。加入1 200 μL 50 mmol/L精氨酸，調(diào)pH值至9.8左右，37 ℃反應(yīng)30 min后加入2 400 μL 酸體系(96% H2SO4∶85% H3PO4∶ddH2O=1∶3∶7，體積比)終止反應(yīng)，再加入 300 μL 3% 2-異亞硝基苯丙酮(ISPF/無(wú)水乙醇)100 ℃ 煮沸 30 min，冷卻穩(wěn)定后520 nm處測(cè)定其吸光度[20]。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

使用SigmaPlot 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果為3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。采用t-test進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆與生物信息學(xué)分析

依據(jù)EST電子拼接獲得的序列設(shè)計(jì)引物，以棉花幼根來(lái)源的RNA轉(zhuǎn)化的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期大小一致的產(chǎn)物，測(cè)序結(jié)果與電子拼接所得序列進(jìn)行比對(duì)，二者的相似度為99.5%，該片段中ORF共1 023 bp，編碼 340個(gè)氨基酸，推斷產(chǎn)物的分子量(MW)為 37 ku，等電點(diǎn)(pI)5.77。預(yù)測(cè)序列中存在跨膜螺旋，無(wú)信號(hào)肽。利用Phyre2對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，其蛋白序列包含13個(gè)α-螺旋和8個(gè)β-折疊，分別占序列的40%和15%，GhARG1三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖1所示，形成三明治夾層結(jié)構(gòu)，β-折疊在蛋白結(jié)構(gòu)的中間一字排開(kāi)，α-螺旋分布其兩側(cè)。

圖1 Phyre2預(yù)測(cè)陸地棉GhARG1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1 Phyre2 predict GhARG1 protein tertiary structure

精氨酸酶在生物中廣泛存在，通過(guò)GhARG1與擬南芥、大豆、人、家蠶、大腸桿菌等精氨酸酶氨基酸序列進(jìn)行Clustal和Expasy在線功能結(jié)構(gòu)域的分析，如表2和圖2發(fā)現(xiàn)，原核生物、動(dòng)物和植物之間精氨酸酶同源性差異極大，GhARG1與擬南芥ARGAH1相似性為88.50%，和ARGAH2的相似性為82.84%，與大腸桿菌相似性則為21.60%。通過(guò)對(duì)比分析GhARG1與Arg和錳(Mn2+)的結(jié)合位點(diǎn)集中在3個(gè)保守區(qū)域，序列在N端155-162處[LIFV]-G-G-D-[HPC]-[SL]-[IVML]-[SAG](A)，182-200處[LFIV]-D-[AS]-H-[PAT]-D-x(11)-H-[AG](B)和266-289處[SH]-[VIFL]-D-[VALI]-D-x(2)-D-[PA]-x(11)-G-[GK]-[LR]-[ST](C)，精氨酸結(jié)合位點(diǎn)為結(jié)合位點(diǎn)H159、D183、H185、P186、D187、H199、A200、D268、D270、E311；精氨酸水解需要Mn2+的參與，Mn2+離子結(jié)合位點(diǎn)H159、D183、H185、>D187、D268、D270，其結(jié)合位點(diǎn)都參與精氨酸的結(jié)合，說(shuō)明這些保守結(jié)構(gòu)域與已鑒定的同源蛋白一致，為精氨酸酶的保守區(qū)域。

表2 棉花GhARG1同源蛋白相似性Tab.2 Homologous proteins similarity of GhARG1

*.L-Arg結(jié)合位點(diǎn)；下劃線.高度保守序列。*.L-Arg binding site； Underline.High conservative sequences.

運(yùn)用MEGA 6.06軟件對(duì)棉花GhARG1蛋白序列與擬南芥等16種植物的同源蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)，結(jié)果表明，GhARG1蛋白序列與可可親緣關(guān)系最近，與可可、番茄和馬鈴薯中同源蛋白有相近的進(jìn)化起源，與擬南芥ARGAH1(NP192629.1)親緣關(guān)系較ARGAH2(NP192626.1)更近，而與苜蓿、大豆的同源蛋白親緣關(guān)系相距較遠(yuǎn)。

2.2 棉花GhARG1基因特異性表達(dá)

為探究棉花GhARG1在滲透脅迫過(guò)程表達(dá)水平的變化，采用qRT-PCR法分析葉片中該cDNA的相對(duì)表達(dá)量，揭示NaCl和PEG脅迫均可上調(diào)該基因1的表達(dá)受滲透脅迫的誘導(dǎo)。為研究調(diào)控GhARG1表達(dá)的信號(hào)通路，采用外源噴施ABA、SA和MeJA等信號(hào)分子的方法，分析1基因?qū)Σ煌に氐膽?yīng)答響應(yīng)，結(jié)果(圖4-C、D、E)顯示，ABA在噴施12 h 可誘導(dǎo)GhARG1的表達(dá)、SA在噴施4～8 h時(shí)極顯著上調(diào)GhARG1的表達(dá)，而MeJA對(duì)GhARG1的表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì)。研究認(rèn)為，棉花內(nèi)源性精氨酸酶基因GhARG1可能通過(guò)ABA、SA信號(hào)途徑參與棉花對(duì)鹽漬和干旱脅迫的響應(yīng)。

圖3 GhARG1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic analysis of plant GhARG1 proteins

不同小寫(xiě)字母顯著差異(P<0.05)；不同大寫(xiě)字母顯著差異(P<0.01 )。Different smaller letters mean significant difference (P<0.05); Different bigger letters mean very significant difference (P<0.01).

2.3 GhARG1基因原核表達(dá)產(chǎn)物分析

將GhARG1開(kāi)放閱讀框序列連接入pCold-TF原核表達(dá)載體的KpnⅠ和XbaⅠ兩限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)之間，獲得pCold-GhARG1重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒用KpnⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，顯示(圖5-A)重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后可獲得與預(yù)期產(chǎn)物一致的電泳條帶。測(cè)序結(jié)果證實(shí)，構(gòu)建的重組載體插入序列與GhARG1的ORF序列完全吻合，證明PCR等操作過(guò)程中未引入突變，插入序列正確。將pCold-GhARG1和空載體質(zhì)粒 pCold-TF分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Transetta(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后裂解細(xì)胞，裂解液經(jīng)離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，顯示(圖 5-B)pCold-GhARG1重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的特異蛋白條帶出現(xiàn)在約90 ku處，此分子量大小接近理論上推測(cè)的pCold-TF標(biāo)簽蛋白(54 ku)與GhARG1(37 ku)的融合蛋白分子量，而對(duì)照菌pCold-TF空載體在55 ku標(biāo)準(zhǔn)條帶附近出現(xiàn)標(biāo)簽蛋白(54 ku)條帶。說(shuō)明GhARG1融合蛋白在大腸桿菌菌株Transetta(DE3)中成功表達(dá)，且以可溶性形式存在。前人已有的研究證明，ARG在Mn2+催化下水解Arg生成一分子尿素和一分子的Orn，尿素和ISPF反應(yīng)的生成物在520 nm有吸收峰，與尿素濃度成正比，通過(guò)檢測(cè)吸光度可測(cè)定粗酶ARG酶活性[20]。在37 ℃，pH值9.3條件下，以每克粗酶干粉每分鐘催化Arg產(chǎn)生1 μmol 尿素的量為一個(gè)酶活力單位(U)，得到酶活性(U/mg)。結(jié)果顯示(圖5-C)，pCold-GhARG1重組菌和pCold-TF對(duì)照菌的ARG粗酶活性存在極顯著差異，pCold-GhARG1重組菌中的酶活性是對(duì)照菌的6倍， GhARG1的原核表達(dá)產(chǎn)物分析。

重組質(zhì)粒pCold-GhARG1的雙酶切鑒定(M1.分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組質(zhì)粒pCold-GhARG1；2.重組質(zhì)粒pCold-GhARG1雙酶切產(chǎn)物)；B.GhARG1原核表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE檢測(cè)(M2.蛋白Marker；1.pCold-GhARG1；2.pCold-TF)；C.pCold-GhARG1重組菌的ARG活性(極顯著：P<0.01)。A.Double digestion of recombined vector(M1.Marker;1.Vector of pCold-GhARG1; 2.Digested production of recombined vector pCold-GhARG1);B.SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression products of GhARG1(M2.Protein Marker;1.pCold-GhARG1;2.pCold-TF); C.ARG enzyme activity of recombinant pCold-GhARG1(Very significant difference: P<0.01).

3 討論與結(jié)論

精氨酸酶催化L-精氨酸分解生成L-鳥(niǎo)氨酸和尿素，為一種Mn2+依賴(lài)型金屬酶[21-22]。晶體結(jié)構(gòu)研究顯示，大鼠、人體內(nèi)精氨酸酶為同源三聚體結(jié)構(gòu)，嗜熱菌(Thermusthermophilus)精氨酸酶為同源六聚體結(jié)構(gòu)，而在植物中則分子量變化較大，為單體或寡聚體結(jié)構(gòu)，如在短豇豆(Vignaunguiculatacylindrica)中可能為同源四聚體結(jié)構(gòu)，擬南芥精氨酸酶則可能為同源或異源二聚體結(jié)構(gòu)[21-22]。在人類(lèi)中HsARG1 定位在細(xì)胞質(zhì)，主要在肝臟中表達(dá)，HsARG2定位于線粒體，主要在腎臟中表達(dá)；在植物中，目前已有的報(bào)道證實(shí)擬南芥中ARGAH1和ARGAH2、水稻OsARG均定位于線粒體[11，14，16]。本研究中克隆獲得的棉花GhARG1編碼產(chǎn)物與擬南芥ARGAH1和ARGAH2相似性為88.50%，82.84%，與人類(lèi)HsARG1和HsARG2的相似性高于20%，GhARG1中的保守結(jié)構(gòu)域與已鑒定的同源蛋白一致，結(jié)合利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)GhARG1表達(dá)產(chǎn)物的酶活性檢測(cè)分析，證明本研究獲得的cDNA序列為棉花精氨酸酶編碼序列。但值得注意的是，SignalP 4.1 Server等信號(hào)肽分析軟件分析未發(fā)現(xiàn)其5′端存在明顯的信號(hào)肽序列，因此，其是否存在與ARGAH1和ARGAH2等相同的亞細(xì)胞定位尚需進(jìn)一步研究。

對(duì)植物精氨酸酶基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控研究表明，信號(hào)分子對(duì)其有較復(fù)雜的調(diào)控模式。茉莉酸甲酯(MeJA)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea) 和蕓薹根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)上調(diào)擬南芥ARGAH2，而對(duì)ARGAH1的表達(dá)沒(méi)有影響[11-12]；同樣，番茄LeARG2響應(yīng)傷害和MeJA的誘導(dǎo)，而LeARG2對(duì)此無(wú)響應(yīng)，但低溫可同時(shí)上調(diào)二者的表達(dá)[13，23]；水稻OsARG受ABA的響應(yīng)，而不受乙烯(ET)、赤霉酸(GA)、萘乙酸(NAA)、生長(zhǎng)素(IAA)、吲哚3-丁酸(IBA)、MeJA、SA、細(xì)胞分裂素(6-BA)等激素的響應(yīng)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，不僅鹽漬、干旱2種滲透脅迫可上調(diào)棉花GhARG1的表達(dá)，信號(hào)分子ABA、SA也可上調(diào)GhARG1的表達(dá)水平，暗示著GhARG1可通過(guò)ABA、SA信號(hào)途徑參與對(duì)鹽漬、干旱的脅迫響應(yīng)。由于作為GhARG1 cDNA序列來(lái)源之一的NCBI中注冊(cè)號(hào)為JZ383123的EST來(lái)源于陸地棉鹽脅迫表達(dá)文庫(kù)，因此，本研究對(duì)鹽脅迫下GhARG1的表達(dá)結(jié)果與其一致。在擬南芥中ARGAH1、ARGAH2的T-DNA插入突變體argah1、argah2均增強(qiáng)了對(duì)鹽漬和干旱脅迫的耐性，表現(xiàn)了與滲透脅迫的負(fù)相關(guān)性[15]。在擬南芥和棉花中存在2種不同的研究結(jié)果可能與二者之間對(duì)精氨酸、鳥(niǎo)氨酸分解代謝的途徑存在差異所致[25]。水稻OsARG的超量表達(dá)不僅可改善氮素受限條件下水稻的產(chǎn)量，也可改變轉(zhuǎn)基因棉花植株根系的生長(zhǎng)發(fā)育，并增加棉纖維的長(zhǎng)度[16，18]。最近，Wang等[26]報(bào)道，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)破壞棉花中該基因結(jié)構(gòu)后，被編輯的轉(zhuǎn)基因棉花根系側(cè)根數(shù)量增加，證明棉花精氨酸酶在其根系發(fā)育中具有重要功能，但其在氮素利用、抗逆性等其他方面是否有與OsARG等相似的功能還需進(jìn)一步研究。

在動(dòng)物中精氨酸酶是目前免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[22]。在植物中，該酶的研究才剛剛起步。本研究結(jié)合序列比對(duì)和原核表達(dá)技術(shù)從棉花中克隆得到了可編碼精氨酸酶的cDNA序列，并對(duì)其分子結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析，將為開(kāi)展其功能和利用研究提供參考。