葉美君, 陸小磊, 劉相真, 張海華, 杜穎穎, 潘勝東

(1. 中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院, 浙江 杭州 310016; 2. 寧波市疾病預(yù)防控制中心, 浙江省微量有毒化學(xué)物健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 寧波 315010)

由中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)(http://www.Chinapesticide.gov.cn)和文獻(xiàn)[1]可知,草甘膦(glyphosate, GLY)和草銨膦(glufosinate, GLUF)是我國(guó)登記的允許茶樹使用的除草劑,茶葉中草甘膦和草銨膦的最高殘留限量(RML)較低,與日本和歐盟等國(guó)家和地區(qū)的RML基本相近(中國(guó)為1.0 mg/kg和0.5 mg/kg,日本為1.0 mg/kg和0.3 mg/kg,歐盟為2.0 mg/kg和0.1 mg/kg)。茶多酚、氨基酸、咖啡堿、茶多糖等700余種內(nèi)源性成分賦予茶葉獨(dú)特的健康保健功能的同時(shí)[2],極大地增加了茶葉中草甘膦和草銨膦檢測(cè)前處理和儀器分析的難度,進(jìn)而影響樣品檢測(cè)的靈敏度(檢出限和定量限)、精密度(重復(fù)性)和準(zhǔn)確度(回收率)。

草甘膦和草銨膦的檢測(cè)方法主要包括離子色譜法(IC)、高效液相色譜-熒光法(HPLC-FD)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[3-5]。草甘膦和草銨膦及其主要代謝物氨甲基磷酸(minomethylphosphonic acid, AMPA)的分子質(zhì)量小、極性大、不溶于有機(jī)溶劑、水溶性強(qiáng),與有機(jī)物有很強(qiáng)的結(jié)合能力,直接分析難度較大[6]。黃嘉樂等[7]采用離子色譜法直接檢測(cè)茶葉中草甘膦和草銨膦,由于其定量限較高,依據(jù)GB 2763-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中該除草劑的RML,該檢測(cè)方法無法滿足日常檢驗(yàn)要求,因此植物源樣品主要采用衍生法間接檢測(cè)。茶葉中氨基酸種類繁多且含量高,草甘膦和草銨膦屬氨基酸類除草劑,該衍生產(chǎn)物與氨基酸衍生產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似,熒光檢測(cè)器分辨能力低,假陽性高,不利于茶葉樣品的準(zhǔn)確分析。氣相色譜-質(zhì)譜法(GB/T 23750-2009)衍生試劑七氟丁醇(HFB)價(jià)格昂貴,衍生劑三氟乙酸酐(TFAA)易揮發(fā),衍生條件苛刻,日常檢驗(yàn)應(yīng)用較少。9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC-Cl)作為氨基酸的保護(hù)基團(tuán),用于固相多肽合成和有機(jī)物合成,也作為衍生試劑常用于氨基酸的定性定量分析[8-11]。Ibáez等[12]、曹趙云等[13]和吳曉剛等[14]將該衍生劑引入氨基酸類除草劑的檢測(cè),Ibáez等報(bào)道了草甘膦、草銨膦和氨甲基磷酸衍生產(chǎn)物(FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA)的質(zhì)譜圖,曹趙云等和吳曉剛等闡明該衍生產(chǎn)物在質(zhì)譜中的裂解途徑。由于FMOC-Cl易溶于有機(jī)溶劑,不溶于水,而形成的衍生產(chǎn)物FMOC-GLY、FMOC-AMPA和FMOC-GLUF溶于水,基于這一特殊的理化特性,以FMOC-Cl為衍生試劑的柱前衍生-高效液相色譜-質(zhì)譜法廣泛應(yīng)用于茶葉中草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸的檢測(cè)[14-21]。

基于FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)技術(shù)成熟,實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單,茶葉樣品的檢測(cè)難點(diǎn)主要集中在提取和凈化等前處理過程,該過程直接決定茶葉樣品中內(nèi)源性物質(zhì)的組成,并影響草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸的衍生反應(yīng)轉(zhuǎn)化率,進(jìn)而影響樣品檢測(cè)的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度。本實(shí)驗(yàn)選取水和0.2%(v/v)甲酸水溶液作為提取劑,超聲、振蕩和旋渦作為提取方式,草甘膦專用柱(Special SPE)、碳十八柱(C18柱)和陽離子交換柱(PCX)作為固相萃取(SPE)的凈化小柱,利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,優(yōu)化提取劑、提取方式和固相萃取凈化小柱,系統(tǒng)研究提取和凈化等前處理過程對(duì)茶葉中草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸檢測(cè)的影響。本文采用UPLC-MS/MS內(nèi)標(biāo)法對(duì)茶葉中草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸定性定量分析,以靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)方法的適用性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

UPLC/TSQ Quantum Access MAX超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);分析天平(感量0.000 1 g,瑞士Mettler Toledo公司); SC-3610低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司); FJ-12A固相萃取裝置(上海京孚儀器有限公司);超純水系統(tǒng)(成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠);漩渦混合器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 試劑與材料

甲醇(色譜純,美國(guó)Tedia公司);乙酸銨(色譜純,美國(guó)Fluka公司);甲酸、37%鹽酸(色譜純,德國(guó)Merck公司);十水四硼酸鈉(分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司);磷酸二氫鉀(分析純,華東醫(yī)藥股份有限公司); FMOC-Cl(衍生級(jí),純度≥ 99.9%,上海安譜科學(xué)儀器有限公司);草甘膦水溶液(100 μg/mL,AccuStandard, Inc);草銨膦(純度99.0%, AccuStandard, Inc);氨甲基膦酸(純度99.0%, Chem Service); 1,2-14C15N草甘膦(GLY-15N,純度96%, TRC); FMOC-GLY和FMOC-AMPA水溶液(10 μg/mL,Dr. Ehrenstorfer); FMOC-GLUF(純度96.2%, Dr. Ehrenstorfer); 100 mg/3 mL草甘膦專用柱(Special SPE,福建昊陽生物科技有限公司); 200 mg/3 mL C18小柱(C18,島津技邇商貿(mào)有限公司); 60 mg/3 mL陽離子交換柱(PCX,博納艾杰爾科技公司);茶粉(茶葉磨碎樣品,按照GB/T 8303-2013制備)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、硼酸鈉溶液和衍生液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:準(zhǔn)確稱取10.0 mg(精確至0.1 mg)固體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),分別用超純水溶解并配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃冰箱中避光保存。將上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和液體標(biāo)準(zhǔn)品逐級(jí)稀釋,配成單標(biāo)準(zhǔn)溶液或混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

50.0 g/L硼酸鈉溶液:稱取9.46 g Na2B4O7510H2O,采用超純水溶解并定容至100 mL。

250 g/L氫氧化鈉溶液:稱取25.00 g NaOH,采用超純水溶解并定容至100 mL。

1.00 g/L FMOC-Cl丙酮溶液:稱取0.10 g FMOC-Cl,采用丙酮溶解并定容至100 mL。

酸度調(diào)節(jié)劑:稱取16.00 g磷酸二氫鉀溶于160 mL水,加入13.4 mL鹽酸和40 mL甲醇,超聲混合均勻。

1.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱:Thermo Hypersil GOLD C18(150 mm×2.1 mm, 1.9 μm);流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%(v/v)甲酸),流動(dòng)相B為甲醇,梯度洗脫條件見表1;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:2.0 μL。

質(zhì)譜電離模式:電噴霧離子化(ESI);電離源極性:正離子模式;霧化氣:氮?dú)?離子噴霧電壓:3 500 V;霧化室溫度:120 ℃;離子傳輸管溫度:350 ℃;碰撞氣:氬氣,0.2 Pa;掃描模式:選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描(SRM)。

表 1 梯度洗脫程序

A: 5 mmol/L ammonium acetate-0.1% (v/v) formic acid aqueous solution; B: ethanol.

1.5 樣品前處理

提取:稱取茶粉2.5 g(精確至0.001 g)置于50 mL具塞聚乙烯離心管中,加入10 μg/mL草甘膦同位素內(nèi)標(biāo)100 μL,再加入20 mL超純水,旋渦提取30 min,以2 500 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min,取上清液待凈化。

凈化:分別移取2.0 mL甲醇和2.0 mL 0.5%(v/v)甲酸水溶液依次活化小柱,準(zhǔn)確移取1.0 mL提取上清液和100 μL酸度調(diào)節(jié)劑于10 mL離心管中混合后移取至小柱,再加入1.0 mL 0.5%(v/v)甲酸水溶液洗脫,采用250 g/L NaOH調(diào)節(jié)流出液至中性并加水定容至3 mL,待衍生。

衍生:取0.6 mL凈化液,分別依次加入0.2 mL 50.0 g/L硼酸鈉溶液,0.2 mL 1.0 g/L FMOC-Cl丙酮溶液,混勻后于25 ℃下衍生2 h, 0.2 μm有機(jī)微孔濾膜過濾,UPLC-MS/MS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化和衍生產(chǎn)物確證

將FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的單標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)質(zhì)譜儀器直接分析,調(diào)節(jié)碰撞能量,以獲得穩(wěn)定性好、信號(hào)強(qiáng)度高的碎片離子,優(yōu)化得到的參數(shù)見表2。

在25 ℃下,GLY、AMPA和GLUF單標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與FMOC-Cl溶液反應(yīng)2 h,將該衍生反應(yīng)溶液進(jìn)質(zhì)譜分析,譜圖顯示該衍生反應(yīng)溶液的離子碎片與FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的單標(biāo)準(zhǔn)溶液離子碎片一致。設(shè)置液相色譜條件和質(zhì)譜參數(shù),經(jīng)UPLC-MS/MS分析,FMOC-GLY、FMOC-GLU和FMOC-AMPA單標(biāo)準(zhǔn)溶液與該衍生反應(yīng)溶液的液相色譜保留時(shí)間一致。由此可見,根據(jù)1.5節(jié)衍生條件和方法,GLY、GLUF和AMPA與FMOC-Cl反應(yīng)的產(chǎn)物為FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA。

表 2 FMOC-GLY、FMOC-GLY-15N、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion pair.

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1GLY、GLUF和AMPA在不同固相萃取柱中的洗脫液用量

選取Special SPE、C18和PCX作為茶葉中GLY、GLUF和AMPA檢測(cè)的凈化小柱,以此考察不同固相萃取柱的凈化效果。為了確保目標(biāo)物完全洗脫,首先進(jìn)行流出液實(shí)驗(yàn),優(yōu)化各種固相萃取柱的洗脫液用量。以2 mL甲醇和2 mL 0.5%(v/v)甲酸水溶液活化小柱,移取1 mL 100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和100 μL酸度調(diào)節(jié)劑混合后移取至固相萃取柱,采用0.5%(v/v)甲酸水溶液為洗脫液,每次分別加入0.5 mL洗脫液,洗脫液用量見表3。

根據(jù)表3數(shù)據(jù)顯示,以0.5%(v/v)甲酸水溶液為洗脫劑,3種固相萃取柱的洗脫液用量相似,均為1 mL,試樣流出液中已存在草甘膦和氨甲基膦酸,前段流出液必須收集。

表 3 目標(biāo)物在不同固相萃取柱中不同洗脫液用量下的洗脫效果

+: the target compounds were detected in eluate; -: none of target compounds were detected in eluate.

2.2.2提取溶劑、提取方式和固相萃取凈化柱的選擇

以水和0.2%(v/v)甲酸水溶液作為提取劑,超聲、振蕩和旋渦作為提取方式,Special SPE、C18和PCX為固相萃取凈化小柱,采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究前處理方法對(duì)茶葉中草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸檢測(cè)的影響,樣品添加水平為0.400 mg/kg,實(shí)驗(yàn)過程如1.5節(jié)所示,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表4,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5,色譜圖見圖1。由圖1可知,在相同的色譜條件下,FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的保留時(shí)間分別約為:FMOC-GLY 4.62 min,FMOC-GLUF 4.91 min, FMOC-AMPA 4.79 min,經(jīng)Special SPE和C18柱凈化,FMOC-GLY和FMOC-GLUF與雜質(zhì)峰尚未完全分離,且雜質(zhì)峰響應(yīng)相對(duì)FMOC-GLY和FMOC-GLUF響應(yīng)較大;經(jīng)PCX柱凈化,FMOC-GLY與雜質(zhì)峰完全分離,FMOC-GLY和FMOC-GLUF響應(yīng)相對(duì)雜質(zhì)峰響應(yīng)較大。

表 4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表 5 GLY、GLUF和AMPA在不同前處理方法中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

圖 1 采用不同固相萃取小柱凈化的FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA色譜圖Fig. 1 Chromatograms of FMOC-GLY, FMOC-GLUF, and FMOC-AMPA purified by different SPE columns

圖 2 不同實(shí)驗(yàn)條件下FMOC-GLY、FMOC-GLUF和 FMOC-AMPA的峰面積Fig. 2 Peak area of FMOC-GLY, FMOC-GLUF, and FMOC- AMPA under different experiment conditions

根據(jù)表5可知,No. 2、No. 4和No. 7的回收率為70%～120%,回收率數(shù)據(jù)尚無顯著差異性和規(guī)律性,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%,滿足檢測(cè)要求。根據(jù)目標(biāo)物的峰面積(見圖2)可知,采用PCX柱的No. 4和Special柱的No. 7, FMOC-GLY和FMOC-GLUF的響應(yīng)較大,采用C18柱的No. 2, FMOC-AMPA響應(yīng)較大。

圖 3 不同實(shí)驗(yàn)條件下FMOC-GLY、FMOC-GLUF和 FMOC-AMPA的信噪比Fig. 3 S/N ratios of FMOC-GLY, FMOC-GLUF, and FMOC- AMPA under different experiment conditions

設(shè)計(jì)低水平添加實(shí)驗(yàn)(在檢出限附近),通過信噪比(S/N)進(jìn)一步確認(rèn)最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案。將添加水平為0.100 mg/kg的茶葉樣品按照No. 2、No. 4和No. 7試驗(yàn)方案和1.5節(jié)的前處理過程進(jìn)行處理,目標(biāo)物的信噪比見圖3。根據(jù)圖3可知,在0.100 mg/kg添加水平下,采用PCX凈化柱的No. 4試驗(yàn)和Special SPE凈化的No. 7試驗(yàn),草甘膦和草銨膦的信噪比較大,氨甲基膦酸在3支凈化柱上的信噪比相似。

綜合回收率、色譜分離度、目標(biāo)物響應(yīng)、雜質(zhì)干擾和低濃度溶液的信噪比等因素,本實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)前處理方法即采用水為提取劑,旋渦為提取方式,PCX柱為凈化小柱。

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、基質(zhì)效應(yīng)、方法檢出限和定量限

分別以PCX柱凈化的茶提取液和純水配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液,以FMOC-Cl溶液進(jìn)行衍生,以目標(biāo)物與草甘膦同位素內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值作為縱坐標(biāo),目標(biāo)物濃度與草甘膦同位素內(nèi)標(biāo)物濃度的比值為橫坐標(biāo),繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線?；|(zhì)效應(yīng)以η表示:η=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率[22]。結(jié)果表明,在1～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)(R2)和基質(zhì)效應(yīng)參數(shù)見表6。由表6可知,η<10%,說明無明顯基質(zhì)效應(yīng),由此可見,草甘膦同位素內(nèi)標(biāo)可以大幅度降低基質(zhì)效應(yīng)。在空白茶葉樣品中添加草甘膦、草銨膦和氨甲基磷酸,并經(jīng)1.5節(jié)樣品前處理方法處理,根據(jù)3倍信噪比(S/N=3)確定方法的檢出限(LOD),根據(jù)0.050 0 mg/kg添加水平的回收率和RSD數(shù)據(jù)確認(rèn)方法的定量限(LOQ)(見表6)。

表 6 線性范圍、基質(zhì)匹配線性方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限

y: ratio of peak areas of target and internal standard;x: ratio of mass concentrations of target and internal standard.

2.3.2方法準(zhǔn)確度和精密度

分別稱取2.50 g茶葉空白樣品,然后加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成低、中、高3個(gè)添加水平(0.050 0、0.400和1.20 mg/kg),按照1.5節(jié)樣品前處理方法進(jìn)行提取、凈化和衍生,然后采用UPLC-MS/MS檢測(cè),每一個(gè)加標(biāo)水平測(cè)定6次,結(jié)果見表7。

表 7 草甘膦、草銨膦和氨甲基磷酸在茶葉中的添加回收率和RSD(n=6)

由表7可知,草甘膦、草銨膦和氨甲基磷酸在低、中、高3個(gè)水平均有著較好的準(zhǔn)確度與精密度,符合實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)要求。

2.3.3與其他方法的比較

目前國(guó)內(nèi)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23750-2009《植物性產(chǎn)品中草甘膦殘留量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法》、SN/T 1923-2007《進(jìn)出口食品中草甘膦殘留量的檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》和SN/T 3983-2014《出口食品中氨基酸類有機(jī)磷除草劑殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》等前處理均采用美國(guó)Bio-Rad CAX陽離子交換樹脂小柱,按照上述標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)茶葉中草甘膦和草銨膦進(jìn)行檢測(cè),經(jīng)過長(zhǎng)期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)諸多問題:Bio-Rad CAX為濕柱,柱體積大,吸附容量小,必須采用常壓過柱方式,洗脫液用量大且水占比高,不易濃縮蒸干,實(shí)際工作中需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力,而且Bio-Rad CAX陽離子交換樹脂小柱價(jià)格昂貴。本實(shí)驗(yàn)采用PCX干柱,柱體積小,可采用減壓過柱方式,采用0.5%(v/v)甲酸水溶液作為洗脫液,洗脫液用量小,在UPLC-MS/MS靈敏度范圍內(nèi),無需濃縮已達(dá)到定量限要求,價(jià)格低廉,可彌補(bǔ)Bio-Rad CAX柱的缺點(diǎn)。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用上述方法檢測(cè)837份綠茶、紅茶、青茶、黑茶、白茶、黃茶、代用茶和速溶茶等茶葉樣品,其中草甘膦陽性樣品29份,殘留量在0.140～2.36 mg/kg之間,草銨膦陽性樣品2份,殘留量分別為0.110 mg/kg和0.130 mg/kg,氨甲基磷酸陽性樣品37份,殘留量在0.120～2.15 mg/kg之間。草甘膦、草銨膦和氨甲基磷酸的檢出率分別為3.46%、0.24%和4.42%。按照GB 2763-2016的草甘膦和草銨膦的MRL判定,茶葉樣品草甘膦超標(biāo)2份,超標(biāo)率為0.24%,茶葉樣品草銨膦未超標(biāo)。目前GB 2763-2016尚未制訂氨甲基磷酸的MRL。

3 結(jié)論

本文采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出最優(yōu)前處理方法,以水為提取劑,旋渦提取,PCX強(qiáng)陽離子交換固相萃取干柱凈化,建立了柱前衍生-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定茶葉中草甘膦、草銨膦及其主要代謝物氨甲基膦酸殘留量的實(shí)驗(yàn)方法。該分析方法高效、便捷,價(jià)格低廉,可操作性強(qiáng),方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度滿足茶葉的日常檢測(cè)要求。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可知,茶葉豐富的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)草甘膦、草銨膦和氨甲基磷酸檢測(cè)影響較大,茶葉基質(zhì)的有效去除是排除假陽性樣品的關(guān)鍵?；谶@一實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)一步深入探討茶葉內(nèi)源性成分對(duì)草甘膦等除草劑衍生反應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)其中的內(nèi)在規(guī)律,可為提取溶劑和提取方式的選擇、凈化材料的開發(fā)和衍生試劑的選取等提供理論和現(xiàn)實(shí)依據(jù)。