藍(lán)夢(mèng)哲, 林 緒, 劉雅瓊, 王海鳴, 曹小彥

(廣州廣電計(jì)量檢測(cè)股份有限公司, 廣東 廣州 510000)

所謂花草茶,是以花卉植物的花蕾、花瓣為材料,經(jīng)過(guò)采收、干燥、加工后制作而成的保健飲品。沖泡花草茶已成為一種流行趨勢(shì),在現(xiàn)代都市里特別受到女性消費(fèi)群體的青睞。人們?cè)絹?lái)越關(guān)注花草茶的搭配方法和保健功效,同時(shí)花草茶的農(nóng)藥殘留問(wèn)題也日益受到人們的關(guān)注。

國(guó)內(nèi)關(guān)于花草茶的檢測(cè)方法主要參照NY/T 761-2008標(biāo)準(zhǔn),該方法適用于蔬菜水果農(nóng)藥殘留的測(cè)定[1]。對(duì)于花草茶而言,其前處理方式缺乏針對(duì)性,無(wú)法有效消除基質(zhì)干擾。農(nóng)藥殘留的分析方法主要有氣相色譜法(GC)[2-7]、高效液相色譜法(HPLC)[8]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[10-18]等。主要的前處理方法有液液分配萃取結(jié)合填充柱凈化、固相萃取(SPE)和QuEChER凈化等。液液分配萃取法需要消耗大量溶劑;填充柱凈化耗時(shí)耗力,步驟繁瑣,不適于大批量樣品的分析;SPE凈化過(guò)程復(fù)雜且價(jià)格偏高。

QuEChERS是由美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)中心開(kāi)發(fā)的一種快速簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、環(huán)境友好的預(yù)處理方法,是實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模樣品處理的理想方法,有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。花草茶含有的成分較多,如多糖類(lèi)、脂質(zhì)、生物堿和多酚類(lèi)化合物等[19-23],對(duì)多組分農(nóng)藥殘留的測(cè)定干擾較大,樣品的萃取凈化和農(nóng)殘目標(biāo)物的富集是實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確分析的前提。目前以QuEChERS為樣品前處理方法,HPLC-MS/MS為檢測(cè)方法進(jìn)行多種類(lèi)花草茶和多種類(lèi)農(nóng)藥多殘留測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道較少。

本文建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)花草茶中77種農(nóng)藥殘留的方法,該法能夠快速、準(zhǔn)確地同時(shí)分離測(cè)定花草茶中77種農(nóng)藥,并已用于實(shí)際樣品檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Nexera X2液相色譜儀(日本島津公司); Triple Quad 4500串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)、Analyst Software儀器控制及數(shù)據(jù)處理軟件(美國(guó)AB Sciex公司)。

77種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)均購(gòu)于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司;甲醇和乙腈(色譜純)、乙酸(優(yōu)級(jí)純)、乙酸銨、N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、石墨化炭黑(GCB)和無(wú)水硫酸鎂(分析純)均購(gòu)于德國(guó)CNW公司。無(wú)水硫酸鎂用前于650 ℃灼燒4 h。

花草茶:玫瑰花、茉莉花、桂花、木棉花、洛神花、雞蛋花、金銀花、菊花等均為干制花草茶,粉碎研磨,過(guò)20目篩,備用。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.1 mg),置于10 mL容量瓶中,以乙腈定容,配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;用乙腈稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液,于-18 ℃儲(chǔ)存;用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)中間液配制成各濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于4 ℃儲(chǔ)存。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取花草茶樣品約2 g,置于50 mL聚乙烯離心管中,用5 mL超純水浸泡30 min,加入20 mL 1%(v/v)乙酸乙腈、1 g乙酸銨、4 g無(wú)水硫酸鎂(若5 mL超純水不足以浸泡2 g花草茶樣品,則每加入5 mL超純水就加入4 g無(wú)水硫酸鎂)和2 g氯化鈉,渦旋提取,以4 000 r/min離心5 min。取10 mL提取液,加入0.5 g C18、0.5 g PSA、0.05 g GCB和100 μL甲苯,渦旋振蕩,以6 000 r/min離心5 min,取1 mL上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜,待測(cè)進(jìn)樣分析。

1.4 HPLC-MS/MS條件

色譜柱:Venusil MP C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 3 μm);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流速:0.3 mL/min;流動(dòng)相:(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)乙腈。梯度洗脫條件:0～5.00 min, 10%B～90%B; 5.00～8.00 min, 90%B; 8.00～8.01 min, 90%B～10%B; 8.01～11.00 min, 10%B。

離子源:電噴霧電離(ESI)源;掃描方式:正離子、負(fù)離子交替掃描;檢測(cè)方式:MRM模式;氣簾氣流速:30 L/min;霧化氣流速(GS1): 50 L/min;輔助加熱氣流速(GS2): 50 L/min;碰撞氣(CAD):中等強(qiáng)度(medium);輔助加熱氣溫度:500 ℃;噴霧電壓:5 000 V(ESI+)/-4 500 V(ESI-)。77種農(nóng)藥的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞能量、去簇電壓、碰撞室入口電壓和碰撞室出口電壓見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要包括選擇各化合物的母離子、子離子、去簇電壓、碰撞能量等。取20 μg/L的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用針泵進(jìn)樣的方式,首先進(jìn)行母離子掃描(Q1 scan),獲取待測(cè)物的母離子,然后通過(guò)子離子掃描獲取其碎片離子,最后在MRM模式下優(yōu)化各質(zhì)譜參數(shù),優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。加標(biāo)玫瑰花花草茶中化學(xué)成分較復(fù)雜,直接用有機(jī)溶劑提取會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng),不利于檢測(cè)。干制過(guò)的花草茶,其含水量小于10%,不利于目標(biāo)化合物的提取。因此,在加入有機(jī)溶劑前,需要加入適量的水浸泡,以改善提取效果。此外,研究表明,乙酸銨的加入能夠防止對(duì)酸堿性敏感的有機(jī)磷酸酯類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的降解[24-26]。因此,實(shí)驗(yàn)比較了采用不同提取劑(乙腈、1%(v/v)乙酸乙腈、乙腈+1 g乙酸銨,1%(v/v)乙酸乙腈+1 g乙酸銨)提取時(shí)加標(biāo)玫瑰花樣品(40 μg/kg)中77種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率(見(jiàn)圖2)。由圖2可知,1%(v/v)乙酸乙腈+1 g乙酸銨作為提取劑時(shí),玫瑰花中77種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在70%～120%的農(nóng)藥有59種,基本滿足要求,因此以此選為所用。

表 1 77種農(nóng)藥的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

表 1 (續(xù))

* Quantitative ion.

圖 1 加標(biāo)玫瑰花樣品(40 μg/kg)中77種農(nóng)藥的 總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram of the 77 pesticides in a spiked rose sample (40 μg/kg)

樣品(40 μg/kg)中77種農(nóng)藥的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 QuEChERS方法的優(yōu)化

2.2.1提取劑的選擇

圖 2 采用不同提取溶劑時(shí)玫瑰花中77種農(nóng)藥的回收率分布Fig. 2 Recovery distribution of the 77 pesticides in rose by different extraction solvent

2.2.2吸附劑和吸附劑用量的選擇

QuEChERS方法是通過(guò)基質(zhì)分散固相萃取(MSPD)實(shí)現(xiàn)樣品的凈化。PSA填料可有效去除脂肪酸和有機(jī)酸，主要檢測(cè)的化合物以氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥為主[27-29];C18對(duì)非極性組分具有吸附作用,且能有效去除低極性雜質(zhì)和高級(jí)脂肪酸酯類(lèi)等大分子基質(zhì)干擾物;C18和PSA混合使用能有效去除強(qiáng)極性至弱極性的基質(zhì)干擾物[30]。GCB由于其特殊的六邊形表面結(jié)構(gòu),使其對(duì)含苯環(huán)的有機(jī)物吸附能力較強(qiáng),能有效分離化合物并去除大多數(shù)色素[31]。花草茶含有脂肪酸、糖分、黃酮類(lèi)、色素、類(lèi)酯體和極性物質(zhì)等多種復(fù)雜化合物質(zhì)[32],采用單一吸附劑的凈化效果不明顯,因此本實(shí)驗(yàn)同時(shí)使用3種不同含量的PSA、C18和GCB吸附劑凈化樣品。

當(dāng)玫瑰花中農(nóng)藥加標(biāo)量為40 μg/kg時(shí),分別比較單獨(dú)使用不同用量的GCB(0.05、0.1和0.5 g)、PSA(0.1、0.5和1.0 g)和C18 (0.1、0.5和1.0 g)對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響(見(jiàn)圖3)。當(dāng)GCB、PSA、C18的添加量分別為0.05 g、0.5 g、0.5 g時(shí),回收率在70%～120%之間的農(nóng)藥最多,為70種,約占90%。

圖 3 采用不同吸附劑時(shí)玫瑰花中77種農(nóng)藥的回收率分布Fig. 3 Recovery distribution of the 77 pesticides in rose by different contents of adsorbents GCB: graphitized carbon black; PSA: primary secondary amine.

圖 4 加標(biāo)玫瑰花樣品(40 μg/kg)MSPD前后 77種農(nóng)藥的回收率分布Fig. 4 Recovery distribution of the 77 pesticides in spiked rose samples (40 μg/kg) before and after MSPD MSPD: matrix solid-phase dispersion.

實(shí)驗(yàn)比較了同時(shí)采用0.05 g GCB、0.5 g PSA和0.5 g C18萃取前后,玫瑰花中77種農(nóng)藥的回收率。由圖4可知,分散萃取凈化前,回收率在70%～120%之間的農(nóng)藥僅有59種;凈化萃取后,回收率在70%～120%之間的農(nóng)藥有70種。因此,同時(shí)采用0.05 g GCB、0.5 g PSA和0.5 g C18對(duì)花草茶樣品進(jìn)行凈化萃取。

3種吸附劑可以導(dǎo)致萃取過(guò)程中具有平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥被吸附,有文獻(xiàn)[33]表明添加100 μL甲苯可以提高萃取效率。為了研究甲苯對(duì)于具有平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥的提取效率的影響,比較了添加和不添加甲苯時(shí)時(shí)加標(biāo)玫瑰花樣品(40 μg/kg)的萃取效果。結(jié)果表明,萃取液中加入100 μL甲苯后,有10種平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥化合物,如多菌靈、特丁硫磷等,回收率均有所提高。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除了待測(cè)目標(biāo)物外樣品基質(zhì)中的一些共同提取物對(duì)測(cè)定待測(cè)物含量準(zhǔn)確度的影響?；|(zhì)效應(yīng)主要源自色譜分離過(guò)程中與被測(cè)物共流出的物質(zhì)對(duì)被測(cè)物離子化過(guò)程的影響。基質(zhì)效應(yīng)是在農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí),分析復(fù)雜樣品基質(zhì)需要考慮的重要問(wèn)題之一。和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法不同,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的基質(zhì)效應(yīng)以抑制效應(yīng)為主。因此,為降低離子抑制效應(yīng)對(duì)定量測(cè)定的影響,需要用花草茶空白樣品提取液配制系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

2.4 線性范圍、定量限、回收率和精密度

按1.3節(jié)方法對(duì)空白玫瑰花樣品進(jìn)行前處理,配制系列不同質(zhì)量濃度(1、5、10、20、50、100和200 μg/L)的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,在1.4節(jié)條件下對(duì)77種農(nóng)藥進(jìn)行分析測(cè)定。以農(nóng)藥的色譜峰面積對(duì)各目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明,77種農(nóng)藥在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.995。以3倍信噪比(S/N=3)對(duì)應(yīng)的含量作為方法的檢出限(LOD),為1.0～10.0 μg/kg。

按1.3節(jié)描述對(duì)空白玫瑰花樣品進(jìn)行前處理,并分別加入低、中、高(10、40、80 μg/kg)3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)(n=3)。結(jié)果表明,玫瑰花樣品中77種農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率為70.3%～110.0%，RSD為2.6%～9.8%(見(jiàn)表2)。

表 2 玫瑰花中77種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和檢出限(n=3)

表 2 (續(xù))

2.5 實(shí)際樣品分析

隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)市售玫瑰花、茉莉花、桂花、菊花、洛神花、木棉花、雞蛋花、金銀花8種花草茶,共30份樣品,應(yīng)用所建立的分析方法進(jìn)行農(nóng)藥殘留含量測(cè)定。結(jié)果表明,氧樂(lè)果檢出4份,含量為10.4～22.9 μg/kg;倍硫磷檢出2份,含量分別為8.2 μg/kg和4.9 μg/kg;多菌靈檢出4份,含量分別為3.9～19.7 μg/kg。同時(shí)對(duì)上述8種花草茶樣品進(jìn)行40 μg/kg水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),77種農(nóng)藥的回收率為70.3%～110.0%,精密度為1.9%～9.4%(n=6)。

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS測(cè)定花草茶中77種農(nóng)藥殘留的方法,該法簡(jiǎn)便快速,使用溶劑少,靈敏可靠,有較強(qiáng)的針對(duì)性和適應(yīng)性。該法提高了實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)速率和檢測(cè)通量,為花草茶中多種藥物殘留的例行檢測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等提供了高效可靠的分析手段。