覃 玲, 董亞蕾, 王鋼力, 曹 進, 丁 宏

(中國食品藥品檢定研究院, 北京 100050)

獸藥在防病治病、促進生長方面應用廣泛,但在畜牧養(yǎng)殖過程中存在一定的濫用、誤用現(xiàn)象,常造成藥物在動物體內(nèi)的蓄積,進而引起相應食材的污染,可能使人體產(chǎn)生耐藥性或過敏反應等副作用,威脅人民飲食健康。目前國際上通常用最大殘留限量(MRLs)值作為判斷動物源性食品質(zhì)量安全的標準,比較成熟的MRLs標準體系主要有國際食品法典委員會(CAC)、歐盟、美國、日本以及中國等[1-3]。建立快速、靈敏、簡便、可靠的獸藥殘留檢測方法勢在必行,對于保障人民飲食安全具有重要意義。

目前,國內(nèi)外的獸藥殘留檢測方法主要有液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜[4-7]、液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜[8,9]和液相色譜-四極桿離子阱質(zhì)譜[10-12]。針對磺胺類[13]、喹諾酮類[14]、糖皮質(zhì)激素類[15]、β-受體激動劑類[16]等單類獸藥的檢測已有諸多研究,而這些分析方法所能同時分析的藥物種類較少,無法滿足目前獸藥種類不斷增加的檢測需求,不利于潛在風險的發(fā)現(xiàn)。動物源性食品中多類獸藥殘留同時分析方法的開發(fā)具有廣闊的應用前景,可縮短檢測周期,降低檢測成本,提高檢測效率[17,18]。

在前處理技術(shù)方面,動物源性食品中獸藥殘留分析常采用液-液萃取[17]、固相萃取[19-22]、分散固相萃取[23-25]等方法,以去除基質(zhì)干擾,凈化目標化合物,提高多獸藥殘留檢測的靈敏度。本文選擇豬肉、牛肉鮮肉樣品及豬肉脯、牛肉干干肉制品4種代表性基質(zhì),應用分散固相萃取方法結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜,建立了同時測定磺胺類(9種)、β-受體激動劑類(8種)、喹諾酮類(7種)、糖皮質(zhì)激素類(6種)、孕激素類(2種)、氯霉素類(2種)、鎮(zhèn)靜劑類(2種)以及雄激素類、硝基咪唑類、苯并咪唑類、抗病毒類、林可胺類、大環(huán)內(nèi)酯類(各1種)共13類42種獸藥殘留的分析方法,為動物源性食品中多獸藥殘留的多成分快速篩查與確認提供檢測依據(jù)。本文在傳統(tǒng)獸藥殘留檢測選取的鮮肉基質(zhì)基礎(chǔ)上,考察了更為復雜的肉制品基質(zhì),具有一定的創(chuàng)新性。分散固相萃取前處理方法較傳統(tǒng)固相萃取前處理方法更為快速、便捷,具有更廣闊的應用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-MS 8060三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司); arium pro-DI-B純水機(德國Sartorius公司); CF 16RXⅡ離心機(日本HITACHI公司); XP205分析天平(十萬分之一)和AL204分析天平(萬分之一)(瑞士Mettler公司)。

甲醇、乙腈(均為質(zhì)譜純,ThermoFisher公司);甲酸(質(zhì)譜純,Fluka公司);甲酸(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);實驗室用水為超純水;WondaPak QuEChERS多獸殘專用提取包與凈化包(日本島津技邇公司); 42種獸藥標準品分別購自德國Dr. Ehrenstorfer公司和中國食品藥品檢定研究院,純度90.3%～99.9%。

實際樣品購自當?shù)爻小?/p>

1.2 標準溶液的配制

分別以甲醇配制質(zhì)量濃度為1 g/L的各獸藥標準儲備液,其中吡哌酸用10%(v/v)醋酸甲醇溶液配制。取適量儲備液,以甲醇配制42種獸藥混合標準溶液,其中妥洛特羅、班布特羅、氟哌啶醇的質(zhì)量濃度為10 mg/L,其余為50 mg/L,置于-18 ℃下避光保存。

分別吸取適量標準工作溶液用空白基質(zhì)提取液稀釋定容,配制成不同濃度的基質(zhì)匹配標準溶液。

1.3 樣品前處理方法

鮮肉樣品:準確稱取均質(zhì)后的樣品2.50 g于50 mL塑料離心管中,加入3 mL水渦旋混合1 min,再加入5 mL 5%(v/v)甲酸乙腈渦旋混合1 min,超聲提取10 min。加入WondaPak QuEChERS多獸殘專用提取包4 g,劇烈振搖1 min,于10 ℃以8 000 r/min下離心10 min。取1 mL上清液轉(zhuǎn)移至WondaPak QuEChERS多獸殘專用凈化包中,渦旋混合1 min, 12 000 r/min下離心5 min。取上清液,過0.22 μm微孔濾膜,取濾液進行LC-MS/MS分析。

干肉制品:準確稱取絞碎后樣品2.50 g于50 mL塑料離心管中,直接加入5 mL 5%(v/v)甲酸乙腈,同法進行提取與凈化。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Shim-pack GIST C18柱(100 mm×2.1 mm, 2 μm);柱溫:30 ℃;進樣量:5 μL;流動相:A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為甲醇。梯度洗脫程序:0～4 min, 5%B～30%B; 4～10 min, 30%B～60%B; 10～12 min, 60%B～95%B; 12～17 min, 95%B; 17～18 min, 95%B～5%B; 18～23 min, 5%B。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:多反應監(jiān)測(MRM)掃描;霧化氣流速:3 L/min;干燥氣流速:5 L/min;加熱氣流速:15 L/min;加熱模塊溫度:300 ℃;脫溶劑管溫度:250 ℃;離子源溫度:250 ℃。42種獸藥的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 42種獸藥的質(zhì)譜參數(shù)

tR: retention time; CE: collision energy. *Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究對比了Shim-pack GIST C18柱和Waters CORTECS UPLC C18柱的分離效果,發(fā)現(xiàn)后者喹諾酮類化合物峰形差、響應低,磺胺噻唑、地西泮、炔諾酮峰分叉;而前者的分離效果和峰形都更優(yōu),因此最終選用Shim-pack GIST C18柱。

本研究采用甲醇作為有機相,考察了在水相中添加0.1%(v/v)甲酸、10 mmol/L乙酸銨、10 mmol/L甲酸銨對色譜分離和質(zhì)譜響應的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加甲酸銨和乙酸銨時喹諾酮類化合物峰形差、響應低;添加甲酸時提高了在正離子模式下檢測的目標物的響應值,在負離子模式下檢測的3種目標物也能獲得合適的響應值,且峰形良好、分離效果佳。因此,本研究最終采用甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液作為流動相。42種獸藥化合物的總離子流圖見圖1。

圖 1 42種獸藥的總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatograms of the 42 veterinary drugsFor peak Nos., see Table 1.

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源下,分別對各獸藥化合物的標準溶液進行正離子和負離子全掃描,確定各化合物的準分子離子;將其作為母離子進行二級質(zhì)譜掃描,選取豐度較強、干擾較小的兩對子離子為特征離子,其中豐度相對最強的為定量離子,其次為定性離子;進一步優(yōu)化碰撞能量和Q1、Q3四極桿電壓。優(yōu)化得到的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

在多殘留檢測中,離子駐留時間(dwell time)對靈敏度和定量準確性有重要影響。采集通道的增加會使分配給每個采集通道的離子駐留時間減少,而維持長的離子駐留時間又會影響每個MRM通道的采集點數(shù),進而影響圖譜質(zhì)量與定量準確性。為了保證同時檢測42種獸藥的靈敏度與準確性,需要權(quán)衡離子駐留時間和采集點數(shù)兩個因素。本研究采用分段掃描模式進行不同化合物數(shù)據(jù)的采集,根據(jù)出峰時間分為4段:3～7 min, 6～8 min, 7～12 min, 11～15 min;從而減少了采集通道的冗余,保證了離子的駐留時間。

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇

本研究涉及的42種獸藥極性較強,而畜肉中主要基質(zhì)干擾是蛋白質(zhì)、脂肪及少量色素。選取極性溶劑進行提取,可保證提取效率,又盡可能地去除了基質(zhì)中的干擾物。乙腈、甲醇具有良好的沉淀蛋白質(zhì)及提取目標化合物的能力,然而用甲醇提取時會帶入更多的極性基質(zhì)干擾物,影響提取效率,因此選擇乙腈作為提取溶劑。以豬肉基質(zhì)為例,當在乙腈中加入適量甲酸或乙酸時,由于大部分目標化合物呈弱堿性,離子化效率得到提高,平均提取回收率明顯增加;而甲酸酸性強于乙酸,平均提取回收率稍大于乙酸。實驗進一步對乙腈中甲酸的添加比例進行了探索,發(fā)現(xiàn)5%(v/v)甲酸乙腈的平均提取回收率高于1%(v/v)甲酸乙腈與10%(v/v)甲酸乙腈;其中磺胺類化合物在酸度偏低時,在溶液中的解離度降低,影響了提取回收率;而在酸度偏高時,可能發(fā)生一定程度的降解,也影響提取回收率[26]。本研究還進行了80%(v/v)乙腈水溶液的提取回收率實驗,發(fā)現(xiàn)不如5%(v/v)甲酸乙腈的提取回收率高。因此,最終選擇5%(v/v)甲酸乙腈作為提取溶劑。不同提取溶劑對42種獸藥平均回收率的影響見圖2。

圖 2 不同提取溶劑對42種獸藥平均回收率的影響Fig. 2 Effect of different extraction solvents on the average recoveries of the 42 veterinary drugsMeOH: methanol; HAc: acetic acid; ACN: acetonitrile.

由于畜肉樣品比較黏稠,絞碎后不容易分散。勻漿機廣泛用于分散畜肉樣品,然而部分樣品會附著在勻漿機的搗桿上造成目標化合物的損失。實驗發(fā)現(xiàn),水具有良好的組織滲透性,當在樣品中預先加入水時,能夠良好地分散樣品,增加有機溶劑與樣品的接觸面積;而且水的極性強,對于強極性化合物的提取能力也強。因此,在提取樣品時應預先加入少量水分散樣品。干肉制品黏稠度小,直接采用提取溶劑就可均勻分散,不需加入水。

2.3.2凈化條件的選擇

本研究涉及13類獸藥的檢測,參考國家標準與出入境檢驗檢疫行業(yè)標準,不同類別獸藥分別用HLB、C18、MCX固相萃取小柱進行凈化,或直接采取液-液萃取方式凈化。以豬肉基質(zhì)為例,考察了HLB、C18以及MCX固相萃取小柱的凈化效果,發(fā)現(xiàn)HLB固相萃取小柱僅對部分磺胺類、喹諾酮類、糖皮質(zhì)激素類、β-受體激動劑類獸藥以及羅紅霉素、氯霉素回收率高;C18固相萃取小柱平均回收率為67.86%,其中磺胺噻唑、恩諾沙星、雙氟沙星、氟哌啶醇、沙美特羅的回收率極低;MCX固相萃取小柱僅對部分β-受體激動劑類獸藥回收率高。

根據(jù)文獻[27],本工作考慮采用基質(zhì)分散固相萃取的方法進行凈化。WondaPak QuEChERS多獸殘專用提取包與凈化包及Agilent Bond Elut EMR-Lipid萃取包與反萃管是基于基質(zhì)分散固相萃取法開發(fā)的產(chǎn)品,實驗比較了這兩種方法的凈化效果,發(fā)現(xiàn)兩者對42種獸藥化合物均有較好的凈化效果,而使用前者回收率稍高于后者,且操作更為方便快捷,因此本實驗選取前者作為提取液的凈化方法。

2.4 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應是由基質(zhì)中的共提干擾物與目標化合物競爭電離所致,對目標化合物的靈敏度、準確度和分析方法的重現(xiàn)性等產(chǎn)生影響。基質(zhì)效應=基質(zhì)匹配校準曲線的斜率/溶劑標準校準曲線的斜率[28],比值越接近1,則基質(zhì)效應越小,反之亦然;若比值在0.8～1.2范圍內(nèi),則表明基質(zhì)效應不明顯。4種樣品的基質(zhì)效應見表2。結(jié)果表明,干肉制品的基質(zhì)效應大于鮮肉樣品,這可能與干肉制品的低含水量有關(guān),且干肉制品的加工工藝復雜,添加的調(diào)料可能增大基質(zhì)干擾,使基質(zhì)效應明顯。4種樣品基質(zhì)中,42種獸藥化合物中的38%以上化合物基質(zhì)效應明顯,其中甲睪酮、福莫特羅最為明顯,因此采用空白基質(zhì)匹配標準曲線以降低基質(zhì)效應的影響。

表 2 42種獸藥在4種樣品基質(zhì)中的基質(zhì)效應

2.5 方法學評價

2.5.1標準曲線、檢出限與定量限

配制基質(zhì)匹配混合標準溶液,在優(yōu)化的分析條件下進行檢測。以目標化合物定量離子的峰面積對含量做標準曲線,4種動物源性食品樣品中的基質(zhì)匹配標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.995。以定量離子的信噪比(S/N)=3和S/N=10分別計算,各獸藥化合物在4種動物源性食品樣品基質(zhì)中的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別為0.01～1.68 μg/kg和0.01～5.62 μg/kg。各目標化合物在牛肉基質(zhì)中的線性關(guān)系、LOD和LOQ見表3。

表 3 (續(xù))

Y: peak area;X: content, μg/kg.

2.5.2回收率與精密度

在鮮豬肉、鮮牛肉、豬肉脯、牛肉干4種空白樣品中進行3個水平的加標回收試驗,每個水平進行6次平行試驗,加標水平從小到大標記為Level 1、2、3。在鮮肉樣品中,妥洛特羅、班布特羅的添加水平為2、8、40 μg/kg,氟哌啶醇的添加水平為8、20、40 μg/kg,萊克多巴胺、恩諾沙星、馬布特羅的添加水平為10、40、100 μg/kg,甲砜氯霉素的添加水平為40、100、200 μg/kg,其余獸藥化合物的添加水平均為10、40、200 μg/kg。在干肉制品中,妥洛特羅、班布特羅、氟哌啶醇的添加水平為8、20、40 μg/kg,萊克多巴胺、恩諾沙星、馬布特羅的添加水平為10、40、100 μg/kg,其余獸藥化合物的添加水平為40、100、200 μg/kg。

結(jié)果(見表4)表明,4種基質(zhì)中所有化合物回收率的RSD均小于15%,滿足精密度要求。大多數(shù)化合物在4種樣品基質(zhì)的3個添加水平下的平均回收率為65.8%～135.5%,相對標準偏差為0.5%～14.2% (n=6),結(jié)果較為理想。對于回收率低于一般定量要求的個別化合物,在實際測定中,可以考慮采用折算的方式對含量進行估算,繼而開發(fā)單獨的方法進行準確定量測定。

表 4 42種獸藥在4種樣品基質(zhì)中的加標回收率(n=6)

表 4 (續(xù))

* Nos. are the same as in Table 3.

2.6 實際樣品測定

采用本研究建立的分析方法對購自超市的豬肉、牛肉及豬肉脯、牛肉干、手撕牛肉、火腿腸、香腸類肉制品進行檢測。其中,豬肉制品的定量測定以豬肉脯基質(zhì)匹配標準曲線來計算,牛肉制品的定量測定以牛肉干基質(zhì)匹配標準曲線來計算。在一例牛肉樣品中檢出環(huán)丙沙星,其保留時間差異低于0.5 min,豐度比偏差低于20%,檢出含量為53.4 μg/kg,其他樣品中均無藥物殘留檢出。雖然代表性基質(zhì)可能無法完全匹配新類型樣品的基質(zhì)性質(zhì),但對于樣品中獸藥殘留的含量測定也具有一定的參考意義。若通過此法篩查出了目標化合物,要增加相應基質(zhì)匹配標準曲線進行準確定量計算。由于本方法的靈敏度高、檢出限低,使用代表性基質(zhì)匹配標準曲線進行定量計算對于樣品中的風險物質(zhì)監(jiān)測不會造成假陰性結(jié)果。

3 結(jié)論

本文利用基質(zhì)分散固相萃取方法結(jié)合高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法,建立了4種代表性的動物源性食品樣品基質(zhì)中13類42種獸藥殘留的測定方法。該方法快速、簡便、靈敏,能夠?qū)悠分械哪繕嘶衔镞M行準確的定性和定量分析,適用于動物源性食品樣品中多獸藥殘留的快速檢測。