王曉歡, 陳磊

(天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 天津 300072)

隨著新藥的不斷開(kāi)發(fā),藥物分子呈現(xiàn)出更為復(fù)雜多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì),對(duì)復(fù)雜藥物的分離分析提出了更高的要求。高效液相色譜(HPLC)作為一種有效的分離手段在藥物分析方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。反相色譜(RPLC)以其對(duì)疏水性化合物較強(qiáng)的選擇性和靈敏度,在藥物分析中應(yīng)用廣泛。但其對(duì)強(qiáng)極性和離子型化合物的保留較弱,在分離堿性化合物時(shí)常導(dǎo)致峰形拖尾、柱效和重復(fù)性變差[1]。離子交換色譜(IEC)常用于分離可解離或離子型化合物,但對(duì)于帶相同電荷而疏水部分有差異的化合物分離度較差[2]。離子對(duì)色譜(IPC)克服了以上困難,通過(guò)在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑,增加了離子型化合物在反相色譜中的保留,能夠同時(shí)分離中性和離子型化合物[3]。然而由于離子對(duì)試劑的引入造成柱平衡時(shí)間較長(zhǎng),并且與質(zhì)譜不兼容,不適用于梯度洗脫和制備純化,這些缺陷都限制了IPC在分離分析中的廣泛應(yīng)用。

模仿IPC與離子型化合物的多種作用,混合模式色譜(MMC)依靠表面的多功能基團(tuán),在不使用離子對(duì)試劑的情況下,能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜樣品的分離[4-6]。反相/離子交換色譜(RP/IEC)因其高度的正交性,是開(kāi)發(fā)和研究最多的混合模式色譜,在核苷酸及蛋白質(zhì)分離[7,8]、藥物雜質(zhì)檢測(cè)[9-11]、代謝研究[12]、天然產(chǎn)物分離純化[13,14]等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

近年來(lái),關(guān)于混合模式色譜制備和應(yīng)用的報(bào)道很多,但對(duì)其保留機(jī)理的系統(tǒng)研究卻很少且存在爭(zhēng)議[15-19]。這是由于RP/IEC鍵合多種功能基團(tuán),溶質(zhì)的保留受反相和離子交換兩種作用的影響[19,20],使得其色譜保留機(jī)理變得更復(fù)雜。最初,研究人員通過(guò)考察反相色譜上堿性化合物與疏水鏈和解離硅羥基的作用來(lái)探討RP/IEC的混合保留機(jī)理。Yang等[15]研究了堿性化合物在C18和聚丁二烯修飾二氧化鋯(PBD-ZrO2)兩種固定相上的保留機(jī)理,在不同鹽濃度流動(dòng)相中,觀察一系列對(duì)烷基芐胺同系物的色譜行為,認(rèn)為兩個(gè)固定相上反相和離子交換兩種位點(diǎn)單獨(dú)起作用。Neue等[17]提出了三種作用形式的保留模型,表明除上述兩種單獨(dú)作用外,還存在兩個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)作用,稱之為反相協(xié)同的離子交換作用,并且該作用對(duì)帶電堿性化合物在C18固定相上的保留具有重要影響。Zhang等[18]探討了幾種堿性化合物在反相/弱陽(yáng)離子交換色譜(RP/WCX)上的保留行為,采用反相和離子交換兩種作用形式保留模型,考察了流動(dòng)相中不同類型反離子的影響。綜上所述,對(duì)于RP/IEC混合模式色譜的保留機(jī)理,多數(shù)研究者更傾向于兩種位點(diǎn)單獨(dú)作用的保留模型,而忽略了協(xié)同作用的影響。

巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)[21,22]具有條件溫和、簡(jiǎn)單高效、反應(yīng)可控、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn),在色譜固定相修飾方面具有潛在優(yōu)勢(shì)。本文通過(guò)巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)鍵合苯磺酸(單配體)或同時(shí)鍵合苯基和苯磺酸(雙配體)得到兩種硫醚嵌入型反相/強(qiáng)陽(yáng)離子交換(RP/SCX)混合模式固定相。在混合模式色譜條件下,分離了4種強(qiáng)堿性藥物,系統(tǒng)考察了其在不同流動(dòng)相條件下的保留行為。探討了三種作用形式保留模型的合理性,進(jìn)行了定量分析,揭示了反相/離子交換協(xié)同作用的重要影響,為混合模式色譜固定相設(shè)計(jì)和分離條件的優(yōu)化提供了重要的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Vario Micro Cube元素分析儀(德國(guó)Elementar公司),安捷倫1100高效液相色譜分析儀,配G1322A脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1329A柱溫箱、G1314B紫外檢測(cè)器和ChemStation色譜工作站(美國(guó)安捷倫公司)。

球形硅膠(粒徑:10 μm,比表面積:292 m2/g,平均孔徑:10 nm,天津市倍思樂(lè)色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)中心),巰丙基三甲氧基硅烷(MPTMS,純度98%,湖北武大有機(jī)硅新材料股份有限公司),對(duì)苯乙烯磺酸鈉(SS,純度99%,上海源葉生物科技有限公司),苯乙烯(St,純度99%,天津市大茂化學(xué)試劑廠),三乙胺(TEA)、甲醇、無(wú)水乙醇和乙腈(純度均為99%,天津市康科德科技有限公司),偶氮二異丁腈(AIBN)、正己醇、四氯化碳和正己烷(純度均為99%,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所),硫酸沙丁胺醇、鹽酸普魯卡因胺、鹽酸可樂(lè)定、鹽酸普萘洛爾和鹽酸阿米替林標(biāo)準(zhǔn)品(純度均為99%,中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

1.2 RP/SCX混合模式固定相的制備

RP/SCX混合模式固定相的制備途徑如圖1所示。以球形多孔硅膠為原料,經(jīng)氣固相硅烷化反應(yīng)得到巰丙基修飾的硅膠中間相;再經(jīng)巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)鍵合上疏水鏈和磺酸基,得到RP/SCX固定相。典型步驟如下:稱取4 g酸化后的硅膠微球于聚四氟乙烯反應(yīng)釜中,加入1.8 mL(9.6 mmol)MPTMS和1 mL(7.2 mmol)TEA,于150 ℃馬弗爐中反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后依次用甲醇、甲醇-水(1∶1, v/v)、甲醇洗滌,于80 ℃真空干燥過(guò)夜,得到巰丙基硅膠微球(MPS)。將4 g MPS微球和80 mL甲醇分散于150 mL反應(yīng)瓶中,然后加入0.04 g(0.24 mmol)AIBN, 0.165 g(0.8 mmol)SS和184 μL(1.6 mmol)St,振蕩溶解,通氮?dú)獬鹾竺芊?放于70 ℃恒溫水浴搖床中震搖12 h,過(guò)濾,依次用甲醇、甲醇-水(1∶1, v/v)、甲醇洗滌,80 ℃真空干燥過(guò)夜,得到苯基和苯磺酸修飾的雙配體混合模式固定相(Ph/BS)。和上述合成途徑相同,用SS代替SS和St的混合物,得到苯磺酸修飾的單配體混合模式固定相(BS)。

圖 1 Ph/BS固定相合成路線圖Fig. 1 Synthesis route of phenyl/benzenesulfonate (Ph/BS) stationary phaseTEA: triethylamine; AIBN: azobisisobutyronitrile; MeOH: methanol; MPS: mercaptopropyl silica.

1.3 色譜柱的裝填

采用高壓勻漿法裝柱。稱取適量微球樣品,超聲均勻分散于正己醇-四氯化碳混合溶液(1∶1, v/v)中,在30 MPa的壓力下,以正己烷為頂替液,將固定相填充到150 mm×4.6 mm不銹鋼柱管中。

1.4 色譜條件

流動(dòng)相:乙腈-50 mmol/L KH2PO4(50∶50, v/v, pH 3.0),檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm,流速:1.5 mL/min,柱溫:30 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 RP/SCX混合模式固定相的表征

圖2為MPS和Ph/BS填料的紅外譜圖?？梢钥闯?與MPS相比,Ph/BS顯示出較強(qiáng)的苯環(huán)特征吸收峰。其中,700和580 cm-1處分別為苯環(huán)碳?xì)涞拿嫱鈴澢駝?dòng)峰和苯環(huán)骨架的伸縮振動(dòng)峰。1 082 cm-1處為硅氧鍵的伸縮振動(dòng)峰,在1 500 cm-1附近Ph/BS較MPS明顯變寬,這是由于與磺酸基相連的苯環(huán)的伸縮振動(dòng)引起的。2 939 cm-1處為苯環(huán)上的碳?xì)渖炜s振動(dòng)峰,與巰丙基側(cè)鏈上亞甲基的碳?xì)渖炜s振動(dòng)峰重疊,使得峰強(qiáng)增加。綜上表明,苯基和苯磺酸基團(tuán)已成功鍵合在Ph/BS固定相表面。

圖 2 巰丙基硅膠微球(MPS)和Ph/BS填料的紅外譜圖Fig. 2 IR spectra of MPS and Ph/BS packings

采用元素分析儀對(duì)混合模式色譜填料進(jìn)行定量表征,結(jié)果如表1所示。根據(jù)文獻(xiàn)公式[23],巰丙基和苯基的表面覆蓋率(αMP和αPh)通過(guò)碳含量計(jì)算,苯磺酸的表面覆蓋率(αBS)通過(guò)硫含量計(jì)算。結(jié)果表明,通過(guò)氣固相反應(yīng)得到了較高的巰丙基鍵合量,Ph/BS和BS固定相表面的苯磺酸鍵合量基本相同,且Ph/BS固定相上成功鍵合了苯基基團(tuán)。由于兩種混合模式固定相都是在同一批巰丙基硅膠上鍵合的,所以它們色譜行為的差異可以歸結(jié)為修飾的功能配體不同。

表 1 巰丙基硅膠微球和混合模式固定相的元素分析

αMP: surface coverage of mercaptopropyl groups;αPh: surface coverage of phenyl groups;αBS: surface coverage of benzenesulfonic acid.

2.2 分離堿性藥物

在藥物分析中,堿性藥物的色譜分離一直是被關(guān)注的熱點(diǎn)。由于堿性基團(tuán)的解離,堿性藥物在反相色譜和離子交換色譜分離過(guò)程中拖尾嚴(yán)重,這與硅膠表面殘余硅醇基導(dǎo)致的“二級(jí)解離平衡”有關(guān)[1]。為避免這種效應(yīng),常需要選擇酸性條件,抑制硅醇基解離(pKa為5～7)。因此,本文制備了兩種以苯磺酸(pKa=-2.8)[24]為離子交換基質(zhì)的RP/SCX混合模式固定相,以期在低pH條件下使堿性化合物獲得較好的峰形并提高分離的選擇性。選擇沙丁胺醇(pKa=9.4, logP=1.69, logP為油水分配系數(shù))、普魯卡因胺(pKa=9.2, logP=3.00)、可樂(lè)定(pKa=8.05, logP=3.11)和普萘洛爾(pKa=9.42, logP=3.77)4種結(jié)構(gòu)差異較大的強(qiáng)堿性藥物作為探針,對(duì)其在不同流動(dòng)相條件下的保留行為進(jìn)行了研究。

考察了溫度對(duì)溶質(zhì)的色譜保留行為的影響,發(fā)現(xiàn)從20 ℃增加到60 ℃,溶質(zhì)的保留時(shí)間明顯縮短。但溫度較低時(shí),由于溶質(zhì)傳質(zhì)變慢,峰形展寬,使得柱效較低;溫度較高時(shí),幾種溶質(zhì)的分離度變差,尤其是在BS固定相上堿性藥物會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的重疊現(xiàn)象,而且高溫會(huì)降低色譜柱的穩(wěn)定性和縮短其使用壽命。因此,綜合柱效、保留和穩(wěn)定性3方面考慮,選取30 ℃進(jìn)行堿性藥物的保留機(jī)理考察。

圖 3 堿性藥物保留因子(kT)對(duì)流動(dòng)相pH作圖Fig. 3 Plots of retention factor (kT) vs. mobile phase pH for basic drugsa. BS phase; b. Ph/BS phase.

2.3 pH的影響

流動(dòng)相pH影響堿性化合物的解離程度,從而改變其在混合模式固定相上的保留。保持流動(dòng)相中鹽濃度和有機(jī)相比例不變(50 mmol/L KH2PO4-乙腈(50∶50, v/v)),改變pH,考察其對(duì)堿性藥物保留行為的影響。從圖3a可見(jiàn),在pH 3～10范圍內(nèi),堿性藥物在BS固定相上均得到較好的保留。由于苯磺酸的pKa為-2.8,在此過(guò)程中均處于完全解離狀態(tài)。在pH 3條件下,出峰次序?yàn)樯扯“反?普魯卡因胺<可樂(lè)定<普萘洛爾。除可樂(lè)定外,在pH 3～8之間,隨流動(dòng)相pH的增加,另外3種堿性化合物的保留逐漸增加,在pH=8時(shí)保留最強(qiáng)。這是由于硅膠表面的硅醇基解離程度增加,與堿性藥物間發(fā)生了離子相互作用,從而導(dǎo)致保留增加。當(dāng)pH>8時(shí),堿性藥物的保留迅速減弱,是因?yàn)楦遬H條件下堿性物質(zhì)的解離受抑制,與磺酸基間的離子相互作用減小,主要靠反相作用保留。可樂(lè)定的pKa比其他3種堿性藥物小,所以在pH>6時(shí)即出現(xiàn)解離被抑制的現(xiàn)象。從圖3b可見(jiàn),在Ph/BS固定相上,堿性藥物的保留隨pH改變呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。但與BS固定相相比,在整個(gè)pH考察范圍內(nèi),堿性藥物在Ph/BS上的保留更強(qiáng)。在高pH條件下,普魯卡因胺和普萘洛爾在BS固定相上共出峰,而在Ph/BS上卻能得到較好的分離。這說(shuō)明疏水性苯基的存在對(duì)化合物的保留和分離有重要的影響。

2.4 離子強(qiáng)度的影響

依據(jù)離子交換理論,流動(dòng)相中緩沖鹽影響離子型化合物與固定相間的離子相互作用。對(duì)于單純離子交換色譜,單價(jià)離子溶質(zhì)的保留與流動(dòng)相中的反離子濃度呈反比[15]:

(1)

其中,kIEX代表單純離子交換保留因子,[C+]代表流動(dòng)相中單價(jià)反離子濃度(mmol/L),BIEX代表離子交換常數(shù),BIEX與固定相的離子交換容量、溶質(zhì)與固定相間的離子交換平衡常數(shù)及相比有關(guān)。

保持流動(dòng)相的pH和有機(jī)相比例不變(pH 3.0 KH2PO4-乙腈(50∶50, v/v)),考察了離子強(qiáng)度對(duì)堿性藥物保留行為的影響。從圖4可見(jiàn),在兩個(gè)固定相上,隨鹽濃度減小,堿性藥物的保留增強(qiáng),并且保留因子與鹽濃度的倒數(shù)均呈很好的線性關(guān)系,說(shuō)明在固定相上存在離子交換作用。根據(jù)公式(1),如果只存在單純的離子交換作用,截距應(yīng)為0。從表2可見(jiàn),兩個(gè)固定相的截距都大于0,說(shuō)明還存在其他作用。

圖 4 堿性藥物kT對(duì)流動(dòng)相中鹽濃度倒數(shù)作圖Fig. 4 Plots of kT vs. inverse buffer concentration for basic drugs a. BS phase; b. Ph/BS phase.

對(duì)于RP/IEC混合模式色譜,多數(shù)研究者[15,16]認(rèn)為,溶質(zhì)的總保留因子(kT)受反相作用(保留因子kRP)和離子交換作用(保留因子kIEX)的獨(dú)立影響,用公式(2)表示:

(2)

Neue等[17]提出,除這兩種單獨(dú)作用外,還存在反相協(xié)同離子交換作用(簡(jiǎn)稱協(xié)同作用,kRP/IEX)?；谧杂赡墀B加原理,kRP/IEX可以表示為k*RPk*IEX,因?yàn)閰f(xié)同作用中的反相和離子交換與單純的反相和離子交換不一定相同,故加星號(hào)以區(qū)分。因此,總保留因子kT可以表示為以下關(guān)系:

kT=kRP+kIEX+k*RPk*IEX=

(3)

根據(jù)公式(2)和(3),不管協(xié)同作用是否存在,總保留因子與鹽濃度的倒數(shù)都呈正比,并且截距代表反相保留。由表2可知,在兩個(gè)固定相上,沙丁胺醇的截距最小，普萘洛爾的截距最大。由于沙丁胺醇和普魯卡因胺logP較小,所以在兩個(gè)固定相上的截距差別比較小;而對(duì)于疏水性較強(qiáng)的可樂(lè)定和普萘洛爾,在Ph/BS固定相上的截距比BS固定相上的截距大,說(shuō)明疏水性苯基增加了固定相的反相保留。由于兩個(gè)固定相的苯磺酸鍵合量基本相同,單純離子交換作用近似一致。然而觀察斜率發(fā)現(xiàn),對(duì)于相同溶質(zhì),在Ph/BS固定相上的斜率比BS固定相上的斜率明顯增加,并且反相作用越強(qiáng)的堿性藥物斜率相差越大。這說(shuō)明斜率與其反相作用有關(guān),因此公式(3)中的三種作用形式的保留模型更適合于RP/SCX混合模式色譜的保留行為研究。

表 2 堿性藥物kT對(duì)鹽濃度倒數(shù)作圖的截距、斜率和相關(guān)系數(shù)(r2)

kRP: retention factor based on reversed-phase retention.

根據(jù)公式(3),kT減去kRP可以求得單純離子交換和反相協(xié)同離子交換兩種離子交換作用的總保留值(kIEX+k*RPk*IEX)。從表3可見(jiàn),在兩個(gè)固定相上,隨著鹽濃度增加,堿性藥物的kRP保持不變,總離子交換作用(kIEX+k*RPk*IEX)減小。Ph/BS固定相與BS固定相相比,同一溶質(zhì)在相同條件下,kRP差別不大或增加,但是總離子交換作用增加更為明顯,對(duì)于反相作用最強(qiáng)的普萘洛爾,其總離子交換作用增加將近一倍。另外,在兩個(gè)固定相上都是總離子交換作用占主導(dǎo),除沙丁胺醇外,其他3種堿性藥物在Ph/BS固定相上的總離子交換貢獻(xiàn)反而比BS固定相強(qiáng)。以上現(xiàn)象說(shuō)明Ph/BS固定相上增加苯基,一方面提高了固定相的反相保留行為,另一方面明顯增強(qiáng)了協(xié)同效應(yīng),使得總離子交換的保留和貢獻(xiàn)增加。原因可能是:在BS固定相上,當(dāng)堿性藥物同時(shí)與苯磺酸自身的反相和離子交換基團(tuán)作用時(shí),才有協(xié)同效應(yīng);而在Ph/BS固定相上,協(xié)同作用還可以發(fā)生在磺酸基和鄰近的苯基之間,這種協(xié)同作用對(duì)堿性藥物的保留和選擇性有很大的影響。因此,除了可以改變不同的流動(dòng)相條件外,還可以通過(guò)調(diào)節(jié)雙配體中離子基團(tuán)和疏水基團(tuán)的比例來(lái)設(shè)計(jì)不同類型的固定相,以滿足不同的分離需求。

表 3 堿性藥物在BS和Ph/BS固定相上各作用保留值及總離子交換貢獻(xiàn)(T)

kIEX: retention factor based on ion-exchange retention;k*RPk*IEX: retention factor based on hydrophobically assisted ion-exchange retention (cooperative retention).

2.5 有機(jī)溶劑強(qiáng)度的影響

維持流動(dòng)相pH 3和整個(gè)體系總離子強(qiáng)度25 mmol/L不變的情況下,僅改變流動(dòng)相中乙腈的比例(體積分?jǐn)?shù)為35%～50%),考察有機(jī)溶劑強(qiáng)度的影響。從圖5可見(jiàn),隨流動(dòng)相中乙腈比例增加,堿性藥物的保留明顯減小,這與大多數(shù)溶質(zhì)在反相色譜中的保留行為一致。

在反相色譜中,對(duì)于有機(jī)相和水相的二元混合體系,在一定的有機(jī)溶劑強(qiáng)度范圍內(nèi),反相保留與有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)(φ)的關(guān)系符合線性溶劑強(qiáng)度理論(LSS)[25]:

logkRP=logkW-Sφ

(4)

logkRP代表溶質(zhì)在反相色譜中的保留值;logkW代表溶質(zhì)在純水相條件下的保留,與固定相的疏水性有關(guān);S表示斜率(大小與流動(dòng)相組成和溶質(zhì)有關(guān))。

從圖5可知,4種堿性藥物的logkT對(duì)φACN作圖沒(méi)有呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系,而是都表現(xiàn)為向下凹的曲線。在其他有關(guān)混合模式的文獻(xiàn)[26,27]中也觀察到了這種彎曲現(xiàn)象。原因是,在RP/SCX混合模式色譜中,控制流動(dòng)相中總離子強(qiáng)度不變的情況下,隨有機(jī)溶劑強(qiáng)度的增加,反相作用會(huì)減小,而單純離子交換作用基本不變[20]。所以,直接將公式(3)取對(duì)數(shù),不能得到logkT與φ的直線關(guān)系。只有當(dāng)單純離子交換作用貢獻(xiàn)很小時(shí),logkT與φ作圖才有較好的線性關(guān)系。由于兩個(gè)固定相的離子交換容量相當(dāng),可以近似根據(jù)圖5的截距比較兩個(gè)固定相的疏水性,從表4可知,Ph/BS的截距大于BS,說(shuō)明鍵合苯基增加了固定相的疏水性,與之前的結(jié)果吻合。

圖 5 堿性藥物保留因子對(duì)數(shù)與流動(dòng)相中乙腈體積分?jǐn)?shù)作圖Fig. 5 Plots of log kT vs. acetonitrile volume percentage in mobile phase for basic drugsa. BS phase; b. Ph/BS phase.

ColumnSolutelog kTSloper2BS salbutamol1.010.990.994 procainamide1.681.620.991 clonidine1.791.770.998 propranolol2.553.050.996Ph/BS salbutamol1.221.210.998 procainamide2.032.110.992 clonidine2.182.140.998 propranolol2.793.180.995

2.6 Ph/BS固定相色譜評(píng)價(jià)

選用5種堿性化合物對(duì)Ph/BS固定相進(jìn)行色譜評(píng)價(jià)。從圖6和表5可見(jiàn),5種堿性藥物得到很好的分離,并且峰形對(duì)稱,對(duì)稱因子(AS)都較小。除普魯卡因胺外,其他堿性化合物的拖尾因子(Tf)都在0.95～1.05范圍內(nèi)。隨保留時(shí)間延長(zhǎng),色譜峰相應(yīng)變寬,但并不影響柱效和峰形。而且,柱效遠(yuǎn)高于藥典對(duì)這5種藥物提出的理論塔板數(shù)的要求(12 000～14 000 plates/m)。由于實(shí)驗(yàn)所用硅膠微球目標(biāo)粒徑為10 μm,其理論板高(h)在3～4之間,可以滿足商品柱對(duì)柱效的要求。

目前許多商品的SCX固定相已經(jīng)用于堿性化合物的分離[28-31],并得到較好的分離效果。雙配體Ph/BS固定相與商品SCX固定相相比具有明顯優(yōu)勢(shì)。首先,通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)方法引入磺酸基團(tuán),延長(zhǎng)了疏水側(cè)鏈,增加了反相保留;其次,從上述機(jī)理討論可知,在保證一定的離子交換容量的前提下,Ph/BS固定相也可以通過(guò)調(diào)節(jié)疏水性苯基的鍵合量來(lái)調(diào)控反相保留行為,對(duì)于疏水性不同的離子型化合物具有更強(qiáng)的選擇性。

另外,硫醚嵌入基團(tuán)對(duì)色譜保留性質(zhì)也具有重要的影響[32-34]。首先,接近硅膠表面的極性嵌入基團(tuán)對(duì)于硅羥基具有一定的屏蔽作用,從而減小堿性化合物與硅醇基作用引起的拖尾現(xiàn)象;其次,極性嵌入基團(tuán)能夠與流動(dòng)相中的水分子形成氫鍵,增加固定相表面的極性,從而獲得高水相兼容性的特點(diǎn);最重要的是,硫-芳環(huán)之間會(huì)形成電子供體-受體體系,使得芳香化合物的保留和平面選擇性明顯增加。

圖 6 Ph/BS固定相分離堿性藥物色譜圖Fig. 6 Chromatogram of the separation of the basic drugs on Ph/BS stationary phase

Solutetr/minN/(plate/m)hAsTfRsSalbutamol6.75265203.770.961.027-Procainamide13.08258933.860.811.2009.57Clonidine17.57314933.170.931.0384.73Propranolol23.79293003.410.990.9765.05Amitriptyline43.07325403.070.911.0109.87

tr: retention time;N: theoretical plate number;h: theoretical plate height;As: symmetrical factor;Tf: tailing factor;Rs: resolution; -: none.

3 結(jié)論

制備了兩種RP/SCX混合模式固定相,5種堿性藥物均獲得了較好的分離,并且峰形對(duì)稱。系統(tǒng)考察了流動(dòng)相pH、離子強(qiáng)度和有機(jī)溶劑強(qiáng)度的影響,表明存在反相、單純離子交換和反相協(xié)同離子交換3種作用,證明了三種作用形式的保留模型更適合混合模式固定相的機(jī)理研究。定量分析結(jié)果表明,在兩種固定相上單純離子交換和反相協(xié)同離子交換構(gòu)成的總離子交換作用占主導(dǎo),并且反相協(xié)同離子交換作用對(duì)溶質(zhì)的保留和分離選擇性影響很大,雙配體固定相上增加疏水性苯基明顯增加了協(xié)同效應(yīng)。與文獻(xiàn)[25]報(bào)道不同,單純離子交換存在條件下,混合模式色譜中應(yīng)用LSS公式,不能得到良好的線性關(guān)系。綜上所述,依據(jù)三種作用形式的混合保留機(jī)理,不僅可以從流動(dòng)相角度,通過(guò)改變流動(dòng)相組成調(diào)節(jié)各作用的占比來(lái)優(yōu)化色譜分離;還可以從固定相度角度,通過(guò)靈活改變各類型配體的比例來(lái)滿足不同的分離要求。本研究對(duì)于新型色譜固定相設(shè)計(jì)及復(fù)雜樣品的分離優(yōu)化具有重要理論指導(dǎo)意義。