陳 高，代祥德，邵景杰，任三國，陳禪友

（江漢大學 生命科學學院；湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056）

菜豆（Phaseolus vulgarisL.）屬于豆科菜豆屬草本植物，又稱四季豆、蕓豆，菜豆可以食用籽粒或食用豆莢，營養(yǎng)價值豐富，富含大量的蛋白質(zhì)、氨基酸及多種礦質(zhì)元素，是世界上許多地區(qū)的主要植物蛋白來源之一。采用傳統(tǒng)的方法栽培菜豆時其產(chǎn)量會受到光周期、氣候、病蟲害等外部因素的影響［1］，而植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以不受外界環(huán)境的限制，并在較短的時間內(nèi)繁殖出較大數(shù)量的再生植株［2-3］。另一方面，通過基因工程技術(shù)可將外源基因?qū)氩硕辜毎?，培養(yǎng)出抗病、抗蟲的優(yōu)良菜豆種質(zhì)資源，而建立完善的菜豆離體再生體系則是進行菜豆轉(zhuǎn)基因的必要環(huán)節(jié)之一［4］。

在豆科植物組織培養(yǎng)中，最早是用豌豆的莖段誘導出愈傷組織并得到了再生植株［5］，隨后豇豆、大豆、蠶豆及菜豆等豆科植物也被作為離體再生培養(yǎng)材料進行了研究［6-9］。雖然組織培養(yǎng)的快速繁殖技術(shù)已經(jīng)在農(nóng)業(yè)上廣泛應用，但豆科植物在組織培養(yǎng)中能再生植株的種類仍然不多，存在再生困難、存活率低等問題，而且種子越大的豆科植物越難再生，同一種類而不同基因型的豆科植物的培養(yǎng)條件也相差較大［10］。因而國內(nèi)外關(guān)于菜豆組織培養(yǎng)技術(shù)的研究一直進展緩慢，且大多處于試驗階段，目前未建立系統(tǒng)的離體再生體系，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化［4，11］。不同激素配比與外植體的選擇均是影響菜豆組培效果的重要因素，目前常用的激素配比多為生長素與細胞分裂素的不同組合。而菜豆子葉節(jié)具有腋芽的特殊結(jié)構(gòu)，且生長迅速、出芽快，是菜豆離體再生的良好材料來源。因而本文以菜豆子葉節(jié)為外植體，研究了不同生長素即吲哚丁酸（IBA）和萘乙酸（NAA）以及細胞分裂素6-芐基腺嘌呤（6-BA）和激動素（KT）對菜豆子葉節(jié)誘導不定芽和根的影響，并對菜豆組培生根苗進行煉苗和移植，獲得完整植株，為進一步建立菜豆離體再生體系，進行菜豆組織快繁及菜豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供實驗基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

菜豆“Bean white rice”種子由江漢大學湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心收集并提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的獲取 選取顆粒飽滿、大小一致的菜豆種子200粒，清水沖洗30 min后0.1%升汞消毒8 min，無菌水震蕩清洗5～8次，去除殘留在種子上的升汞。最后用無菌水浸泡種子4 h，使其充分吸脹，倒掉浸泡液，用無菌濾紙吸干種子表面水分，接種于MS培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿3粒種子。消毒和接種過程均在超凈工作臺上進行。在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照時間12 h/d。

1.2.2 菜豆子葉節(jié)不定芽誘導 培養(yǎng)5 d后，選取長勢一致的無菌苗，在超凈工作臺上切除其子葉節(jié)上下兩端及兩片子葉，使節(jié)點上端保留約2～5 mm，下端保留約5～10 mm。將子葉節(jié)接種于不同激素濃度配比的不定芽誘導培養(yǎng)基中，接種時子葉節(jié)下端插入培養(yǎng)基，使用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，每瓶接種3個子葉節(jié)，每組激素配比接種3瓶作為平行，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照時間12 h/d。培養(yǎng)3周，培養(yǎng)過程中注意觀察污染情況，并切除長度2 cm以上的不定芽。每隔7 d轉(zhuǎn)一次培養(yǎng)基，記錄一次數(shù)據(jù)，繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基與初代培養(yǎng)相同，記錄芽長為0～2.0 cm和≥2.0 cm的不定芽個數(shù)并計算不定芽分化系數(shù)。培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的生長素IBA和NAA以及細胞分裂素6-BA和KT，激素配比如表1所示。

1.2.3 不定芽生根誘導 誘導出不定芽后，切取長勢較好、長度在2 cm以上的不定芽接種于不同激素濃度配比的生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照時間12 h/d。每7 d觀察記錄不定芽生根情況，生根培養(yǎng)基激素配比如表2所示。

1.2.4 煉苗和移栽 培養(yǎng)數(shù)周后，選取生長狀態(tài)較好、生根較多較粗壯的再生苗，移栽到裝有滅過菌的培養(yǎng)土（腐殖土與砂3∶1）的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)1周后將培養(yǎng)瓶的封口膜揭開，每天定時加水，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照時間12 h/d，觀察移栽苗的生長狀況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

分化系數(shù)=外植體上分化的不定芽數(shù)/外植體數(shù)；

生根率（%）=生根的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%；

數(shù)據(jù)分析軟件采用Microsoft Excel 2013和DPS v7.05處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜豆子葉節(jié)不定芽誘導結(jié)果

如表3所示，在培養(yǎng)1周后，除A號培養(yǎng)基中的子葉節(jié)長出根外，其他子葉節(jié)的傷口膨大形成愈傷組織，B～H號培養(yǎng)基的子葉節(jié)芽點生長狀態(tài)不佳。I～P號培養(yǎng)基中的子葉節(jié)生長狀況良好。培養(yǎng)2周后，A～H號培養(yǎng)基中的子葉節(jié)腋芽生長緩慢，I～P號培養(yǎng)基則誘導出大量的不定芽。培養(yǎng)3周后，I～P號培養(yǎng)基中的子葉節(jié)仍保持較強活力，芽點繼續(xù)增多，而A～H號培養(yǎng)基中除了A號和E號培養(yǎng)基中的子葉節(jié)保持生長外，其他培養(yǎng)基中的子葉節(jié)開始停止生長，不定芽分化系數(shù)低。切取長度超過2 cm的不定芽后，其他不定芽的生長加快。比較A～D號和E～H號培養(yǎng)基不定芽分化系數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)過高濃度6-BA對不定芽的分化有一定的抑制作用。I～P號培養(yǎng)基加入0.1 mg/L KT或者0.2 mg/L NAA后不定芽誘導數(shù)增加，且讓子葉節(jié)長時間保持活力，出芽質(zhì)量較好，可見0.1 mg/L KT和0.2 mg/L NAA均有利于不定芽的生長。I～P號培養(yǎng)基雖然均能誘導出大量不定芽，但是I～L號培養(yǎng)基的不定芽多于M～P號培養(yǎng)基，可見0.1 mg/L KT比0.2 mg/L NAA能更好地促進不定芽的生長。整體來看，J號培養(yǎng)基誘導出芽最多，且生長狀態(tài)較好，因而本試驗中不定芽誘導效果最好的培養(yǎng)基激素配比為1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。

2.2 不定芽生根誘導結(jié)果

如表4所示，培養(yǎng)1周后，Ⅰ和Ⅱ號培養(yǎng)基中的不定芽開始長出根，Ⅲ和Ⅳ號培養(yǎng)基中不定芽葉片正常生長，但并未生根，Ⅴ～Ⅷ號培養(yǎng)基不定芽下端全部形成愈傷組織，且不定芽葉片開始發(fā)黃。培養(yǎng)2周后Ⅰ和Ⅱ號培養(yǎng)基中的不定芽生根濃密，粗大，Ⅲ和Ⅳ號培養(yǎng)基中也開始長根。培養(yǎng)3周后，生根情況穩(wěn)定，Ⅳ號培養(yǎng)基中的不定芽生根情況較差，而Ⅴ～Ⅷ號培養(yǎng)基中的子葉節(jié)則完全沒生根。Ⅰ、Ⅱ號培養(yǎng)基中接種的不定芽生根迅速，根較粗壯。Ⅲ、Ⅳ號培養(yǎng)基中的不定芽生根較為緩慢，且根較為纖細（圖1）?？梢奍BA的濃度過高會抑制不定芽根的形成。而Ⅴ～Ⅷ號培養(yǎng)基中不定芽接種后下端形成愈傷組織，培養(yǎng)兩周后愈傷組織生長良好，但不定芽葉片開始發(fā)黃脫落，且未生成根，可能是由于NAA加入含量過高引起。本實驗中，Ⅰ號培養(yǎng)基中不定芽生根情況最佳，所以此次試驗中根誘導效果最好的培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L IBA。

表1 不定芽誘導培養(yǎng)基的激素配比Tab.1 Hormone proportioning of adventitious bud induction medium/（mg·L-1）

表2 生根培養(yǎng)基的激素配比Tab.2 Hormone proportioning of rooting medium /（mg·L-1）

表3 培養(yǎng)時間對不定芽分化系數(shù)的影響Tab.3 Impact of culture time on differentiation coefficient of adventitious bud

表4 培養(yǎng)時間對生根率的影響Tab.4 Impact of culture time on rooting rate /%

圖1 不定芽生根情況Fig.1 Rooting results of adventitious bud

2.3 再生苗的煉苗與移栽

生根培養(yǎng)3周后獲得了一定的再生苗（圖2），將其移入裝有培養(yǎng)土的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)1周后，打開培養(yǎng)瓶封口膜，繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)周后，移栽苗仍可正常生長（圖3）。豆科植物再生困難，成功的例子并不多，煉苗移栽存活率低也是原因之一。此次雖然誘導出再生苗，但是煉苗與移植存活數(shù)目較少，暫時難以實現(xiàn)規(guī)?；€需進一步研究提高其存活率。部分再生苗煉苗未成功主要是幼苗太小，根與葉相距q太近，移栽時易導致葉損傷或根未完全埋入土中，且部分根系不夠長，未能有效吸收土壤中的營養(yǎng)與水分。后期研究中還需延長再生苗的煉苗時間，增加其存活率。

圖2 組培再生苗Fig.2 Regeneration seedlings

圖3 移栽苗生長狀態(tài)Fig.3 Transplanting seedlings

3 討論與結(jié)論

在不定芽誘導過程中先長出的不定芽會對后長出的不定芽產(chǎn)生抑制作用，因而需在適當?shù)臅r候切除先長出的不定芽。王萍等［12］和李曉梅［10］在豇豆研究中，分別在接種時和培養(yǎng)7 d時切除腋芽，結(jié)果表明外植體在進行芽誘導7 d后切除主腋芽，可以減少愈傷組織的形成概率，增加不定芽的生長數(shù)量。而本研究也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，子葉節(jié)誘導出不定芽后，切除長度超過2 cm的不定芽后，其他芽的生長加快。另一方面，子葉節(jié)切取的時間和切取時是否攜帶子葉也會影響不定芽誘導率［13］，本實驗采用菜豆不帶子葉的子葉節(jié)做為外植體，選擇種子培養(yǎng)5 d后切取，此時子葉節(jié)活性較強，有利于不定芽的分化。

在組織培養(yǎng)過程中，不同激素濃度的配比是影響組織培養(yǎng)效果的重要因素。細胞分裂素可以促進細胞分裂，對外植體分化有很大影響，而生長素可以促進植物生長［14］。曹榮等［15］和聶王星等［16］以6-BA和TDZ組合的培養(yǎng)基誘導大豆子葉節(jié)，提高了不定芽誘導率，而本實驗在菜豆子葉節(jié)的誘導過程中使用6-BA、IBA和KT的組合，對子葉節(jié)不定芽誘導也有明顯的促進效果。同時，一些營養(yǎng)物質(zhì)也對植物不定芽增殖有促進作用，商宏俐［17］發(fā)現(xiàn)將豇豆種子浸提液加入培養(yǎng)基也能提高增殖率；FRANKLIN等［18］發(fā)現(xiàn)用L-谷氨酰胺取代培養(yǎng)基中的無機氮源也能有效提高出芽率。在后期再進一步研究中可嘗試添加部分營養(yǎng)物質(zhì)，以增加菜豆子葉節(jié)的芽增殖率。

部分研究表明芽誘導生根時加入IBA或NAA可以增加生根率［19］，而商宏利［17］以豇豆不定芽在不加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基上也誘導出了生根苗；單麗輝［20］和劉曉東等［21］在多葉棘豆的生根培養(yǎng)基中加入0.1 mg/L NAA，生根效果非常明顯；而本次試驗中僅加入0.1 mg/L IBA即可成功誘導出根，而再加入0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基反而使不定芽形成愈傷組織，無法生根，可見選擇恰當?shù)募に貪舛扰浔仁呛苤匾摹?/p>

終上所述，添加不同濃度的IBA、NAA、6-BA和KT均對菜豆子葉節(jié)不定芽誘導有一定的促進作用，其中0.1 mg/L KT比0.2 mg/L NAA誘導效果要好，而過高濃度的6-BA會抑制不定芽的生長，綜合比較發(fā)現(xiàn)最佳芽誘導培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。添加低濃度的IBA即可成功誘導出根，過高濃度的IBA反而會導致生根誘導率下降，同時添加較高濃度的NAA會導致愈傷組織的形成，無法生根。綜合比較發(fā)現(xiàn)，最佳生根培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L IBA。本研究通過菜豆子葉節(jié)誘導獲得了完整的再生植株，成功地建立了菜豆離體再生體系。