唐 靜，胡 玲，劉 奉，李小山，趙梓亦，李國(guó)利

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 1.病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室； 2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部 病理學(xué)教研室；3.臨床醫(yī)學(xué)系， 重慶 404120； 4.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 641000)

腎缺血的灌注損傷發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，與氧自由基增多、鈣離子濃度失衡和能量代謝障礙等密切相關(guān)，也是導(dǎo)致急性腎衰竭的主要原因之一[1]。外科手術(shù)中腎缺血再灌注損傷是影響預(yù)后的主要原因之一。缺血再灌注可導(dǎo)致強(qiáng)烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)并產(chǎn)生細(xì)胞凋亡[2]，因此降低缺血再灌注損傷過程中的ERS非常重要。異氟醚是一種外科手術(shù)常用的修飾麻醉劑，對(duì)手術(shù)中產(chǎn)生的缺血再灌注損傷具有調(diào)節(jié)作用[3- 4,7]。本文研究了異氟醚對(duì)腎小管上皮細(xì)胞HK- 2低氧/復(fù)氧模型中ERS及其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人腎小管上皮細(xì)胞系HK- 2(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

1.1.2 試劑 Trizol、實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混液和SuperScript III RT-PCR試劑盒(Life Technology公司)；DMEM完全培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素和10%澳洲胎牛血清(Gibco公司)；DNA序列和引物(上海生工生物技術(shù)公司合成)；Annexin V/PI染色試劑盒(Sigma-Aldrich公司)；Anti-GRP78、Anti-CHOP和anti-caspase- 12 (Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理：將細(xì)胞培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿中，DMEM完全培養(yǎng)基含有10%胎牛血清和100 U/mL青鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)在5% CO2、飽和濕度、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，每72 h更換培養(yǎng)基1次。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)傳代。

將匯合度50%的細(xì)胞置于經(jīng)95% N2-4.5% CO2-0.5% O2混合氣培養(yǎng)箱中放置4 h；加入2.56%異氟醚處理的細(xì)胞為異氟醚組；加入相同體積PBS處理的細(xì)胞為Mock組；常規(guī)條件培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組。

1.2.2 LDH含量的測(cè)定：將不同時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)上清液50 μL加入新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再加入50 μL底物，室溫避光孵育30 min后，加入50 μL反應(yīng)終止液，混勻后室溫放置10 min，在490 nm下讀取吸光度值；然后檢測(cè)細(xì)胞總的LDH值。向原細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入20 μL溶解酶，37 ℃孵育1 h后，每孔加入50 μL底物，室溫避光孵育30 min后，加入50 μL反應(yīng)終止液，混勻后室溫放置10 min，在490 nm下讀取吸光度值。計(jì)算方法為：上清液LDH分光光度計(jì)讀取數(shù)值除去總的LDH分光光度計(jì)讀取數(shù)值。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：向培養(yǎng)于96孔細(xì)胞板中的細(xì)胞加入10 μL/孔MTT(125 mg/L)，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃反應(yīng)2 h；去上清液，PBS沖洗3次并加入50 μL/孔二甲亞砜(DMSO)，室溫避光孵育30 min，在570 nm下讀取吸光度值。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)GRP78和CHOP mRNA：用Trizol提取目的細(xì)胞的總RNA，根據(jù)SuperScript Ⅲ RT-PCR試劑盒說明書操作，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR。PCR程序如下：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸1 min，循環(huán)40次。涉及的引物序列如下：GRP78，F(xiàn)：5′-CATCACGCCGTCCTATGTC G-3′和R: 5′-CGTCAAAGACCGTGTTCTCG-3′；CHOP，F(xiàn): 5′-TCTTGACCCTGCTTCTCTGG-3′ 和R： 5′-GCTGT GCCACTTTCCTTTCA-3′；caspase- 12，F(xiàn)：5′-CATCCAA CGGTGTTCTGGTC-3′和R: 5′-TTGCCTGCAATTTGA GCTGT-3′；β-actin，F(xiàn)：5′-CATGTACGTTGCTATCC AGGC-3′和R：5′-CTCCTTAATGTCA CGCACGAT-3′。

1.2.5 Western blot檢測(cè)GRP78、CHOP和caspase- 12蛋白：目的細(xì)胞按1×106個(gè)細(xì)胞加入500 μL RIPA細(xì)胞裂解液的比例混合，并于液氮和37 ℃溫水浴反復(fù)凍融裂解3次。4 ℃，12 000×g離心10 min沉淀細(xì)胞碎片，收集上清液。常規(guī)方法制備8%～10% SDS-PAGE膠，120 V穩(wěn)定電壓電泳1.5 h分離蛋白；半干轉(zhuǎn)膜法(按恒流0.5 mA/cm2)進(jìn)行轉(zhuǎn)印。將目的抗體按1∶1 000的比例稀釋，并室溫孵育2 h，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)種屬的二抗孵育，ECL顯色，X線暗室曝光并顯影定影。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集處理好的細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI染色試劑盒說明書操作，并用流式細(xì)胞儀分析凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 異氟醚處理對(duì)低氧/復(fù)氧模型HK- 2細(xì)胞損傷和細(xì)胞增殖的影響

低氧/復(fù)氧模型HK- 2細(xì)胞LDH釋放量較對(duì)照組增加，細(xì)胞增殖減少(P<0.05)。與mock組細(xì)胞相比，2.56 %異氟處理4和8 h的LDH降低，MTT升高(P<0.05)(圖1)。

2.2 異氟醚處理對(duì)低氧/復(fù)氧模型16HBE細(xì)胞凋亡的影響

低氧/復(fù)氧模型16HBE細(xì)胞中的凋亡率顯著高于未處理組細(xì)胞(P<0.05)。2.56%異氟醚處理4和8 h時(shí)使細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)(圖2，3)。

*P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with Mock group圖1 異氟醚誘導(dǎo)的HK- 2細(xì)胞低氧/復(fù)氧模型LDH釋放量(A)和細(xì)胞增殖的變化(B)

圖2 異氟醚誘導(dǎo)的HK- 2細(xì)胞低氧/復(fù)氧模型凋亡的annexin V-FITC/PI熒光染色的影響Fig 2 Effect of isoflurane on hypoxia/reoxygenation induced apoptosis by annexin V-FITC/PI

*P<0.05 compared with mock group圖3 異氟醚誘導(dǎo)的HK- 2細(xì)胞對(duì)低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的凋亡率(%)的影響Fig 3 Effect of isoflurane on apoptosis induced by

2.3 異氟醚處理對(duì)低氧/復(fù)氧模型16HBE細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

與mock組比較，4和8 h異氟醚組細(xì)胞的GRP78及caspase- 12的mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05)，1 h異氟醚組變化不明顯(圖4)。各組中的CHOP的mRNA和蛋白水平無明顯變化。并且，4和8 h異氟醚組細(xì)胞的caspase- 3的剪切體比例降低。

*P<0.05 compared with 1 hour treated group； △P<0.01 compared with 1 hour treated group圖4 異氟醚誘導(dǎo)的HK- 2細(xì)胞低氧/復(fù)氧模型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白GRP78，CHOP和caspase- 12的mRNA和蛋白水平變化Fig 4 Effect of isoflurane on GRP78, CHOP, caspase- 12 mRNA and protein levels in HK- 2 cell line induced by ER hypoxia/reoxygenation

3 討論

手術(shù)造成的缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制復(fù)雜。腎小管上皮細(xì)胞具有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，在缺血再灌注過程中，細(xì)胞內(nèi)堆積大量氧自由基，引起Ca2+濃度失衡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙并激發(fā)ERS[5]。ERS對(duì)細(xì)胞起雙向調(diào)節(jié)作用。適度的ERS可以調(diào)節(jié)鈣離子濃度平衡、修復(fù)未折疊蛋白及回復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常分泌功能；而過度ERS則可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加重缺血再灌注損傷[6]。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控對(duì)缺血再灌注損傷的控制關(guān)系密切[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，異氟醚對(duì)腎小管上皮細(xì)胞HK- 2的低氧/復(fù)氧模型具有保護(hù)作用。與未處理組相比，低氧/復(fù)氧模型HK- 2細(xì)胞凋亡率明顯增高，LDH增高，細(xì)胞增殖減少，說明低氧/復(fù)氧處理造成了細(xì)胞損傷及凋亡增加。異氟醚可以明顯減少LDH含量，加速細(xì)胞的增殖。提示異氟醚可以緩解低氧/復(fù)氧處理對(duì)HK- 2細(xì)胞的損傷。Annexin V/PI熒光雙標(biāo)進(jìn)一步確認(rèn)了異氟醚的處理可以減緩低氧/復(fù)氧對(duì)HK- 2細(xì)胞的凋亡作用。RT-qPCR和半定量Western blot結(jié)果顯示，低氧/復(fù)氧處理促進(jìn)了ERS，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase- 12的表達(dá)量增加進(jìn)一步說明，低氧/復(fù)氧處理引起的細(xì)胞凋亡是通過ERS誘發(fā)的。異氟醚對(duì)低氧/復(fù)氧模型腎小管上皮細(xì)胞系的保護(hù)作用可能是通過調(diào)控ERS引起的細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。造模后短時(shí)間異氟醚對(duì)細(xì)胞凋亡無影響，而較長(zhǎng)時(shí)間則明顯降低細(xì)胞凋亡，說明異氟醚對(duì)ERS的調(diào)控需要時(shí)間累積。而長(zhǎng)時(shí)間異氟醚暴露并未明顯降低ERS，提示異氟醚的作用可能是直接抑制ERS引起的細(xì)胞凋亡通路。