肖慧玉，李秀杰，陳菲凡，李 靜，張非凡，劉麗紅，于德欽，李樹壯

(大連醫(yī)科大學 生理學教研室，遼寧 大連 116044)

近年來，隨著工業(yè)發(fā)展，機械性創(chuàng)傷(mechanical trauma, MT)引起了人們的廣泛關注。國家統(tǒng)計局官方數據表明，2015年中國發(fā)生交通事故187 781起，其中死亡率高達30%。心臟作為人類生存的重要器官之一，MT可以引起心肌細胞凋亡[1]，進而引發(fā)的繼發(fā)性心功能障礙嚴重影響受傷患者的生命和生活質量[2]。前期研究發(fā)現TNF-α的過量產生、細胞內氧化應激和Ca2+濃度變化都會導致心肌繼發(fā)性損傷。凋亡細胞在創(chuàng)傷后一段時間內隨時間的延長而增多[3]，因此臨床上盡早采取措施阻斷細胞凋亡具有重要意義。

白楊素(chrysin)是一種天然黃酮類化合物，它主要存在于蜂膠和西番蓮屬植物中。大量研究表明，白楊素可以促使TNF-α介導腫瘤細胞凋亡和抑制病態(tài)血管形成從而發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。白楊素還具有多種生物活性，如抑制細胞增殖[5]和抗高血壓[6]。本研究旨在闡明白楊素在TNF-α和活性氧(reactive oxygen species, ROS)介導MT中能否抑制心肌細胞凋亡和發(fā)揮心臟保護功能，并對其潛在的機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級SD大鼠20只，雄鼠，體質量180～220 g[大連醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證：SCXK(遼)2008- 0002]。

1.1.2 主要試劑：大鼠心肌細胞系(H9c2)、人單核細胞系(THP- 1)(中國醫(yī)學科學研究院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心)；白楊素(大連美侖有限公司，單體純度：99.3%)；TNF-α(Sigma-Aldrich公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司)；MTT 細胞增殖及毒性檢測試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒和ROS 檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)；Fluo4-AM(Dojindo同仁化學研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠分組及處理：將大鼠分為對照組、創(chuàng)傷組(參照制備MT模型文獻[7])、創(chuàng)傷給藥組(創(chuàng)傷前0.5 h腹腔注射白楊素溶液20 mg/kg)和創(chuàng)傷溶劑組(創(chuàng)傷前0.5 h腹腔注射與藥物溶液等體積的DMSO)，每組5只，先后進行在體和離體實驗。

1.2.2 大鼠血流動力學參數檢測：創(chuàng)傷后12 h，麻醉大鼠，沿右頸總動脈插管(PE50)至左心室，用TM_WAVE系統(tǒng)記錄左心室心功能參數：左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、平均動脈壓(MAP)、左心室內壓最大上升速率(+dP/dTmax)和左心室內壓最大下降速率(-dP/dTmax)等指標。計算左心室發(fā)展壓(LVDP=LVSP-LVEDP)，并對以上數據進行統(tǒng)計學分析。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及分組：H9c2細胞：DMEM高糖培養(yǎng)基中加入10% 胎牛血清,4 mmol/L谷氨酰胺,105U/L青鏈霉素，細胞鋪于平皿內，在37 ℃含5% CO2的細胞孵箱中培養(yǎng)。2～3 d換液，細胞增殖至匯合度為70%～80%時進行傳代，傳代至7～13代間，細胞處于對數增殖期時，進行試驗。THP- 1細胞采用1640培養(yǎng)基，其余步驟同上。

不同濃度白楊素對正常H9c2 細胞影響實驗分為空白組、對照組和給藥組?？瞻捉M只需加MTT，對照組不做特殊處理，給藥組在加入MTT之前給予含有0.1%不同藥物濃度的培養(yǎng)基處理。TNF-α作用下不同濃度白楊素對細胞的影響實驗分為空白組、對照組、TNF-α組和白楊素藥物保護組。ELISA檢測TNF-α：在體實驗分為對照組、創(chuàng)傷組、創(chuàng)傷藥物干預組和創(chuàng)傷溶劑組(n=5)；離體實驗分為對照組、脂多糖LPS組、LPS+藥物干預組和LPS藥物溶劑組；THP- 1細胞對照組不予特殊處理；LPS組為THP- 1細胞中加入LPS(1 mg/L)；藥物干預組和溶劑組為藥物和溶劑作用0.5 h后，再加入LPS(1 mg/L)。ROS的檢測實驗中THP- 1細胞分組及處理同ELISA檢測TNF-α的離體實驗；H9c2貼壁細胞樣本分為對照組、TNF-α組、TNF-α+藥物干預組、TNF-α溶劑組,藥物和溶劑組作用0.5 h后，加入TNF-α(10 μg/L)。

1.2.4 細胞存活率的檢測：用MTT比色法檢測細胞存活率。細胞活力/%=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。TNF-α作用下不同濃度白楊素對細胞的影響實驗在加入MTT前，每孔加入TNF-α(10 μg/L)，孵育12 h，其余步驟同上。

1.2.5 原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡：術后24 h取左心室壁心肌組織，4%多聚甲醛常溫固定包埋，制成冰凍切片，后續(xù)步驟按說明書進行。計算時每張切片隨機選取10個視野,每視野計數 100個細胞,以TUNEL染色陽性的凋亡細胞占所有被計數的心肌細胞的百分比作為凋亡指數。

1.2.6 ELISA檢測TNF-α：創(chuàng)傷完畢1.5 h后，麻醉大鼠，取心尖血1.5 mL于離心管(事先加入1%肝素50 μL)中，室溫靜置30 min，離心，取上清，ELISA檢測TNF-α。操作參照試劑盒說明書。在450 nm下測量A值，計算出樣品濃度。

1.2.7 ROS的檢測：THP- 1細胞處理12 h后，按說明裝載探針，各組分別收集離心，取上清，用熒光酶標儀488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長檢測熒光強度。裝載DFCH-DA活性氧探針，測定各組活性氧的A值。H9c2 細胞處理6 h后按上述步驟檢測。

1.2.8 激光共聚焦顯微鏡觀察大鼠心肌細胞內Ca2+濃度：激光共聚焦顯微鏡下以494 nm波長激發(fā),516 nm波長發(fā)射，使用油鏡，放大倍數為63倍，觀察大鼠心肌細胞內Ca2+濃度。每隔10 s拍攝圖像，記錄15 min。得到的細胞鈣熒光圖像用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 白楊素對創(chuàng)傷后大鼠血流動力學參數的影響

本組前期工作發(fā)現，隨著創(chuàng)傷程度增大，心肌細胞凋亡數目也逐漸增加，而200 r/min能造成大鼠非致死性且比較理想的創(chuàng)傷，故用此于后續(xù)實驗。對照組和創(chuàng)傷組大鼠的心室舒縮功能見圖 1所述。

相比于對照組，創(chuàng)傷組LVDP、MAP、+dP/dTmax和-dP/dTmax均明顯下降(P<0.01)，在給予白楊素后心功能各指標較創(chuàng)傷組明顯上升(P<0.01)(圖 1)。

2.2 白楊素對創(chuàng)傷后心肌組織細胞凋亡的影響

創(chuàng)傷組、創(chuàng)傷給藥組和創(chuàng)傷溶劑組凋亡指數與對照組相比均明顯升高(P<0.01)。與創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷給藥組凋亡指數明顯下降(P<0.01)(圖 2)。

2.3 細胞實驗確定白楊素藥物濃度

20、40和80 μmol/L的白楊素藥物濃度作用下細胞存活率分別下降了3%、7%和15%(圖 3)。與對照組相比，TNF-α組的細胞存活率明顯下降(P<0.01),各個藥物干預組細胞存活率均上升(P<0.01)(圖 4)。對正常心肌細胞沒有毒性且在創(chuàng)傷因子TNF-α誘導下又對細胞起保護作用的白楊素藥物濃度為10 μmol/L。

2.4 白楊素對單核細胞和細胞系THP-1 TNF-α釋放的影響

在體實驗中，與對照組相比，創(chuàng)傷組血漿中TNF-α的水平明顯上升(P<0.01)，但創(chuàng)傷給藥組TNF-α的含量較創(chuàng)傷組明顯下降(P<0.01)(圖5A)。

細胞實驗中，結果與在體實驗一致(圖5B)。

2.5 白楊素對細胞內ROS水平的影響

在LPS刺激THP- 1創(chuàng)傷模型中，與對照組相比，LPS組ROS熒光強度顯著上升(P<0.01)。LPS+白楊素組與LPS組相比ROS含量明顯下降(P<0.01)(圖 6A)。

在TNF-α刺激H9c2創(chuàng)傷模型中，結果與上述一致(圖 6B)。

*P<0.01 compared with control group; #P<0.01 compared with trauma group圖1 白楊素對創(chuàng)傷后大鼠血流動力學參數的影響Fig 1 Effect of chrysin on hemodynamic parameters following MT-induced myocardial injury

圖2白楊素對創(chuàng)傷后心肌組織細胞凋亡的影響
Fig2EffectofchrysinontheapoptosisofcardiacmusclecellsfollowingMT-inducedinjury

2.6 白楊素對創(chuàng)傷引起的心肌細胞內鈣離子濃度變化的影響

創(chuàng)傷組和創(chuàng)傷溶劑組，較對照組明顯上升(P<0.01)，而創(chuàng)傷給藥組與創(chuàng)傷組相比，Ca2+濃度明顯下降(P<0.01)(圖7)。

3 討論

隨著當今的醫(yī)療衛(wèi)生條件的逐年提升，創(chuàng)傷造成的直接性損傷可以得到很好的控制，但創(chuàng)傷后造成的MODS已經成為影響創(chuàng)傷病人生存率和生活質量的主要因素[8]。因此， 尋找預防治療繼發(fā)性損傷的藥物是亟待解決的問題。

*P<0.05,#P<0.01 compared with control group圖3 不同濃度白楊素作用下H9c2細胞的存活率Fig 3 Viability of H9c2 cells in different chrysin levels

*P<0.01 compared with control cells; #P<0.01compared with TNF-α-treated cells圖4 TNF-α誘導不同濃度白楊素作用下H9c2細胞的存活率Fig 4 Viability of TNF-α-induced H9c2 cells in different chrysin n=5)

A.effect of chrysin on TNF-α levels in plasma of trauma group;*P<0.01 compared with control;#P<0.01 compared with trauma group; B.effect of chrysin on LPS-induced TNF-α levels in THP- 1 cells;*P<0.01 compared with control cells;#P<0.01 compared with LPS-treated cells

A:fluorescence intensity in LPS-induced THP- 1 cells,*P<0.01 compared with control cells,#P<0.01 compared with LPS-treated cells; B:fluorescence intensity in LPS-induced H9c2 cells,*P<0.01 compared with control cells,#P<0.01 compared with LPS-treated cells

A.confocal image (×63 objective, NA1.4, oil immersion)showing Ca2+labeling; B.Ca2+fluorescence intensity of each group;*P<0.01 compared with control;#P<0.01 compared with LPS-treated cells

在本次實驗中發(fā)現MT后給予白楊素，心功能指標明顯上升，心肌細胞凋亡指數顯著下降，表明白楊素能夠有效改善心功能紊亂。大量的實驗證明TNF-α是引起風心病[9]和慢性心衰竭[10]等心功能紊亂的關鍵因素。同時有研究發(fā)現MT后引起心肌細胞凋亡的關鍵因子也是TNF-α，其中的主要機制為caspase- 8和caspase- 3的激活，以及ROS的大量產生[11]，心肌細胞凋亡后進而導致心功能紊亂。本研究表明白楊素對TNF-α誘導下細胞的存活起保護作用。ELISA檢測結果顯示：與其它組相比，藥物干預組TNF-α釋放顯著降低；熒光檢測結果顯示：藥物干預組較其它組ROS的產生明顯減少。提示白楊素能抑制TNF-α釋放、ROS的產生從而減少心肌細胞凋亡。

氧化應激與細胞內Ca2+的相互關系對心肌損傷的影響也是非常重要的。在本次實驗中機械創(chuàng)傷可導致細胞內Ca2+濃度的升高，而白楊素可以降低細胞內Ca2+的增多。而其中的機制是因為白楊素具有緩解鈣超載和抗氧化應激的作用[12]。

本實驗中應用H9c2細胞系和THP- 1細胞系代替整體動物分離的細胞，是因為整體動物分離得到的心肌細胞受技術和操作等方面的影響更大，穩(wěn)定性不如H9c2細胞系?；谇捌谘芯堪l(fā)現，TNF-α主要來自單核細胞。因此本實驗采用THP- 1細胞系，便于研究TNF-α的釋放。

綜上所述，白楊素可以通過抗氧化作用和降低細胞內鈣超載來改善TNF-α介導的心肌細胞損傷，從而發(fā)揮創(chuàng)傷后心臟保護的作用，這為臨床防治機械性創(chuàng)傷導致的繼發(fā)性心肌損傷和MODS提供新的研究策略。但是對于氧化應激相關分子機制探討還存在一定的局限性，仍需要進一步的工作來深入探討。