邱希斌

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一株銀耳污染菌的分離鑒定及其生長(zhǎng)條件研究

邱希斌1,2

（1. 福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建 福州 350002； 2. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

對(duì)生產(chǎn)中在銀耳子實(shí)體表面發(fā)現(xiàn)的一種產(chǎn)紅色色素的污染菌進(jìn)行分離，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子水平分類鑒定為絲枝蠟蚧霉（）。在pH為8.0、培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，該菌的菌絲生長(zhǎng)最快；其生長(zhǎng)的最佳碳、氮源及用量分別為8%乳糖和6%酵母浸粉。

銀耳；污染菌；鑒定；絲枝蠟蚧霉；分子特性；生長(zhǎng)條件

銀耳（）又名白木耳、雪耳等，有“菌中之冠”的美稱。其美味可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，又具有抗癌等藥用價(jià)值，在市場(chǎng)上非常受歡迎。但銀耳在栽培中，容易受到雜菌污染，導(dǎo)致減產(chǎn)或栽培失敗，其中真菌作為主要病害菌是研究的熱點(diǎn)。

經(jīng)典的微生物分離鑒定方法，主要運(yùn)用選擇性培養(yǎng)基，在適宜的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)而進(jìn)行分離純化，而后根據(jù)菌體在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)特征等作出分類。蘇春麗等認(rèn)為僅依靠經(jīng)典分類學(xué)方法來(lái)對(duì)未知病原菌進(jìn)行細(xì)致分類和準(zhǔn)確鑒定，存在很多難以攻克的壁壘和嚴(yán)重的不足[1]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，White等在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，開(kāi)拓性地為真菌的rRNA基因核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)設(shè)計(jì)了3對(duì)特異引物，命名為ITS 1、ITS 4、ITS 5。這3對(duì)特異性引物，對(duì)于絕大多數(shù)的擔(dān)子菌和子囊菌都表現(xiàn)出了較為良好的可擴(kuò)增特性，這為ITS引物的特異性設(shè)計(jì)，及其成功運(yùn)用于真菌鑒定奠定了重要基礎(chǔ)[2]。

本研究對(duì)銀耳子實(shí)體表面發(fā)現(xiàn)的一種產(chǎn)紅色色素的污染真菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，研究溫度、培養(yǎng)基pH、碳源及氮源對(duì)該菌株的影響，為今后該菌的防治或應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

（1）供試菌株。由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心從被污染的銀耳上分離獲得，命名為FQ-01。

（2）供試試劑。PDA培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g，葡萄糖20 g，馬鈴薯浸粉5 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 L；121 ℃高壓滅菌15 min，制成平板培養(yǎng)基待用。PDB液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯浸粉5 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 L；121 ℃高壓滅菌15 min，待用。

1.2 菌株的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

（1）銀耳污染菌（FQ-01）的分離。從患病的子實(shí)體（圖1）上用滅過(guò)菌的接種針鉤取病原菌的尖端菌絲，移入PDA平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)。再?gòu)臒o(wú)污染的培養(yǎng)皿上用滅過(guò)菌的接種針鉤取前端菌絲，移入新鮮的PDA試管，28 ℃恒溫培養(yǎng)。

圖1 患病的銀耳子實(shí)體

（2）形態(tài)觀察。將污染菌接種至PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)3～5天后，觀察菌落形態(tài)。隨后從培養(yǎng)的菌落上切取一小塊菌塊，轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，接近接種塊2～3 mm處，斜插入一塊無(wú)菌的蓋玻片，待菌絲爬上蓋玻片后，取出在電子顯微鏡下觀察：菌絲生長(zhǎng)形態(tài)，分生孢子梗形態(tài)，分生孢子形態(tài)及大小等。測(cè)定孢子的長(zhǎng)度和寬度，根據(jù)菌落特征形態(tài)、孢子特征，對(duì)FQ-01菌進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)鑒定[3, 4]。

（3）分子生物學(xué)鑒定。將接種至PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)3～5天的菌株，用直徑9 mm 的打孔器在菌落邊緣切取菌塊。接種于PDB培養(yǎng)基中，置于28 ℃的振蕩培養(yǎng)箱中，150 r/min振蕩培養(yǎng)120 h。之后用濾紙過(guò)濾，使用無(wú)菌蒸餾水沖洗7～8次，并置于無(wú)菌濾紙上吸干后待用。

菌絲體使用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA。ITS-r DNA序列擴(kuò)增采用真菌通用PCR 擴(kuò)增引物[5]：ITS1-F：5’-CTT GGTCAT TTA GAG GAA GT-3’ ITS4-R：5’-CCT CCGCTT ATT GAT ATG C-3’ 。PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：基因組DNA（200 ng/μL）2.0 μL，引物ITS1（20 μM）1.0 μL，引物ITS4（20 μM）1.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 25.0 μL，ddH2O 21.0；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

電泳結(jié)束后將瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移至溴化乙錠溶液（1 mg/L）中，浸沒(méi)染色20 min，再用清水漂洗2 min后將凝膠轉(zhuǎn)移至凝膠成像系統(tǒng)，開(kāi)啟紫外觀察，并拍照記錄電泳結(jié)果?；厥盏腜CR產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序在GenBank進(jìn)行同源性比對(duì)，并在NCBI-Blast中選擇重合率較高的菌株，再運(yùn)用MEGA 6.0軟件構(gòu)建FQ-01菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 碳源利用實(shí)驗(yàn)

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。以乳糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉等量替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖。進(jìn)行最佳碳源及最佳添加比例實(shí)驗(yàn)，添加質(zhì)量百分比分別為6%、8%、10%、12%。使用內(nèi)徑為9 mm的打孔器，在已經(jīng)過(guò)活化培養(yǎng)3天的菌株供試平板菌落的同一半徑處打孔取出菌塊，接種到供試平板培養(yǎng)基上，置于28 ℃下正置培養(yǎng)，培養(yǎng)至第三天后開(kāi)始采用直尺十字交叉法測(cè)量菌落的生長(zhǎng)直徑。每隔2天觀測(cè)一次，直到第11天。

1.4 氮源利用實(shí)驗(yàn)

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。以蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨、尿素和酵母浸粉等量加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)行最佳氮源及最佳添加量實(shí)驗(yàn)，添加質(zhì)量百分比分別為6%、8%、10%、12%，其余操作同碳源實(shí)驗(yàn)。

1.5 最適生長(zhǎng)溫度實(shí)驗(yàn)

將菌塊分別接種于新的PDA平板上，分別置于20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、36 ℃五個(gè)不同溫度的生化培養(yǎng)箱內(nèi)正置培養(yǎng)。其余操作同碳源實(shí)驗(yàn)。

1.6 最適pH實(shí)驗(yàn)

將滅菌后的PDA培養(yǎng)基pH分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0后傾注平板，冷卻后接種菌株，置于28 ℃下正置培養(yǎng)。其余操作同碳源實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征

于28 ℃培養(yǎng)9天時(shí)，PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征為：菌絲呈白色絮狀，菌絲體生長(zhǎng)較為致密（圖2-A），在PDA培養(yǎng)皿上，菌落背面呈現(xiàn)紅色或深紅色，色素常常擴(kuò)散到整個(gè)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)（圖2-B），平均生長(zhǎng)速度為4.69 mm/d。

圖2 經(jīng)分離純化的銀耳污染菌（FQ-01）

2.2 顯微觀察形態(tài)特征

電鏡下觀察，F(xiàn)Q-01菌的孢子梗細(xì)胞呈花瓶狀，多為對(duì)生，瓶梗頂端形成卵圓形或橢圓形分生孢子，大小約為1.8 μm×2.0 μm（圖3），且FQ-01菌的菌絲可以侵入銀耳子實(shí)體內(nèi)（圖4）。

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

以提取的FQ-01菌的DNA為模板進(jìn)行ITS擴(kuò)增，擴(kuò)增出的片段結(jié)果如圖5所示，在分子量600 bp左右得到一條清晰的條帶。

分別將測(cè)序得到的FQ-01菌ITS序列，利用BLAST軟件（Basic Local Aligment Search Tool，Ver2126）與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)。軟件構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖6所示，F(xiàn)Q-01菌與strain Z06的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為親密，ITS序列的同源性達(dá)到99%。

圖3 FQ-01菌孢子及孢子梗形態(tài)（A：3000×；B：9000×）

A：正常銀耳，1000×；B：染菌銀耳，2000×。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)絲枝蠟蚧霉（）的主要屬的特征描述[5]：分生孢子梗通常著生于氣生菌絲上，其一至幾個(gè)瓶狀小梗輪生至對(duì)生。這與本文顯微觀察的生物學(xué)特征一致，結(jié)合生物學(xué)和分子學(xué)特征，確定污染菌為絲枝蠟蚧霉（）。

2.4 培養(yǎng)特性

（1）碳源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖7）顯示，F(xiàn)Q-01菌在乳糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較快，其次是蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖培養(yǎng)基，為甘油時(shí)生長(zhǎng)較慢。

不同乳糖濃度培養(yǎng)，F(xiàn)Q-01菌在8%乳糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，以下依次是6%乳糖、12%乳糖和10%乳糖（圖8）。

（2）氮源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖9）顯示，F(xiàn)Q-01菌在酵母浸粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，其次是硝酸鉀培養(yǎng)基、蛋白胨培養(yǎng)基、硫酸銨培養(yǎng)基、尿素培養(yǎng)基，均優(yōu)于未額外添加氮源的對(duì)照PDA培養(yǎng)基。

圖5 FQ-01菌 ITS序列擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖6 FQ-01菌 ITS系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖7 不同碳源培養(yǎng)基FQ-01菌的生長(zhǎng)速度

在相同乳糖濃度培養(yǎng)下，F(xiàn)Q-01菌在6%酵母浸粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，其次是8%酵母浸粉培養(yǎng)基、12%酵母浸粉培養(yǎng)基、10%酵母浸粉培養(yǎng)基（圖10）。

（3）溫度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)Q-01菌菌絲除在36 ℃下停止生長(zhǎng)外，其他溫度均可生長(zhǎng)。28 ℃時(shí)菌落生長(zhǎng)較快，為2.13 mm/d；其次是25 ℃（圖11）。

（4）pH。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH為8時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度較快，為2.46 mm/d；其次為pH 7、6、5，均優(yōu)于pH 4的生長(zhǎng)速度（圖12）。

3 結(jié)果與討論

本研究對(duì)一株產(chǎn)紅色素銀耳污染菌進(jìn)行分離，參考李永紅的研究方法，對(duì)該菌進(jìn)行生物學(xué)分類和分子學(xué)分類鑒定[6]。

污染菌在電鏡下的菌株形態(tài)呈現(xiàn)分生孢子著生于單個(gè)孢子梗上，孢子呈橢圓形，孢子梗呈花瓶狀，梗頂端著生卵圓形或橢圓形分生孢子，產(chǎn)生紅色色素，與絲枝蠟蚧霉的特征相似。通過(guò)ITS測(cè)序進(jìn)行基因序列比對(duì)，與絲枝蠟蚧霉的相似性為99%。綜合生物學(xué)特征和分子學(xué)特征，鑒定該菌為絲枝蠟蚧霉（Lecanicillium aphanocladii）。該菌在以乳糖、酵母浸粉為碳、氮源，pH為8的培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度較快，乳糖、酵母浸粉較適添加量分別為8%和6%。

圖8 不同乳糖含量培養(yǎng)基FQ-01菌的生長(zhǎng)速度

圖9 不同氮源培養(yǎng)基FQ-01菌的生長(zhǎng)速度

圖10 不同濃度酵母浸粉培養(yǎng)基FQ-01菌的生長(zhǎng)速度

圖11 不同溫度FQ-01菌的生長(zhǎng)速度

圖12 不同pH培養(yǎng)基FQ-01菌的生長(zhǎng)速度

蠟蚧霉屬隸屬于子囊菌門（Ascomycota），肉座菌目（Hypocreales），蟲草菌科（Cordycipitaceae）。國(guó)內(nèi)對(duì)該屬的分類研究報(bào)道較少，僅見(jiàn)有名錄，未見(jiàn)詳細(xì)的分類描述及鑒定。謝占玲等對(duì)青海湖耐鹽真菌調(diào)查時(shí)曾分離到[6]，苘娜娜等從浙江省蠶區(qū)的病蠶或病蛹中也曾分離到，和[7]。

真菌能形成化學(xué)穩(wěn)定性高、化學(xué)結(jié)構(gòu)及色調(diào)多樣的色素。例如能合成和分泌各種醌類、酸類、酮類以及一些含氮化合物色素[8]。目前，已獲得高產(chǎn)色素的主要真菌類群有紅曲霉、青霉、擬青霉和蟲草[9]中的一些種。其中，一些不產(chǎn)毒素的青霉，如產(chǎn)紫青霉（Fleroff）等研究報(bào)道較多[10, 11]。Gunasekaran ＆ Poorniammal報(bào)道了一個(gè)產(chǎn)蒽醌類紅色素的青霉新菌株[12]，此菌產(chǎn)生的色素可用于食品和化妝品，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，紅色素的產(chǎn)量可提高7倍。本研究鑒定的產(chǎn)紅色素的絲枝蠟蚧霉菌株，可為天然紅色素在食品和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供新資源。

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Isolation and identification of a funguspathogen ofand its growth conditions

Qiu Xibin1, 2

（1. Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality, National Center for Quality Supervision and Inspection for Processed Food, Fuzhou 350002, China; 2. Fujian Agriculture and Forestry University, College of Food Science, Fuzhou 350002, China）

A kind of fungus pathogen producing red pigment was found on fruit body surface of. The pathogen was identified by morphological and molecular classification as. The experimental results showed that the mycelial growth speed was the fastest when the pH was 8.0 at 28 ℃. The optimal carbon source and nitrogen source for the strain was 8% lactose and 6% yeast extract powder.

; identifition; molecular characterization; growing conditions

S646

B

2095-0934（2018）04-240-05