王康樂 陸震鳴 陳 露 耿 燕 許泓瑜 徐國華 史勁松 許正宏,3

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云芝多糖組分對酒精性肝損傷小鼠的保肝活性測試

王康樂1陸震鳴2*陳 露1耿 燕1許泓瑜2徐國華4史勁松1許正宏2,3

（1. 江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3. 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；4. 江蘇神華藥業(yè)有限公司，江蘇 淮安 211600）

通過對云芝多糖（Polysaccharides，PSK）分級醇沉制備了3個(gè)分子量分布不同的組分PSK-1、PSK-2和PSK-3，并采用NIAAA酒精性肝損傷小鼠模型對這3個(gè)組分的保肝活性進(jìn)行了評價(jià)。結(jié)果顯示：PSK-1（400 mg/kg）的保肝活性優(yōu)于PSK-2和PSK-3，能夠顯著降低血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白固醇（LDL-C）及組織中微量丙二醛（MDA）和游離脂肪酸（NEFA）的水平，同時(shí)提升高密度脂蛋白固醇（HDL-C）的水平。

云芝多糖；分級醇沉；肝功能；血脂；活性評價(jià)

酒精性肝損傷（Alcoholic liver disease，ALD）是長期過量飲用酒精飲品引起的中毒性肝損傷。酒精性肝病已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)急性和慢性肝病的主要類型，也是全球發(fā)病率和死亡率的重要病因之一[1]。大量酒精攝入能夠引起血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白固醇（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、游離脂肪酸（Nonesterified fatty acid，NEFA）、微量丙二醛（Malondialdehyde，MDA）等指標(biāo)的顯著變化[2,3]。

云芝多糖是云芝中的一類主要生物活性物質(zhì)，具有保肝、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物活性[3～5]。但是目前對于云芝多糖中不同組分的結(jié)構(gòu)和活性尚缺深入研究。本研究采用乙醇分級沉淀的方法將云芝多糖純化為3個(gè)不同分子量的組分，并采用酒精性肝損傷小鼠模型比較3個(gè)多糖組分的保肝效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料

云芝多糖（PSK）由江蘇神華藥業(yè)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6小鼠，雄性，6周齡，重18～22 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

聯(lián)苯雙酯購自中國藥品生物制品檢定所；Lieber-DeCarli高脂酒精模型組飼料和Lieber-DeCarli正常組飼料購自南通特洛菲飼料有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）檢測試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）檢測試劑盒、甘油三酯（TG）檢測試劑盒、總膽固醇（TC）檢測試劑盒、高密度脂蛋白固醇（HDL-C）檢測試劑盒、低密度脂蛋白固醇（LDL-C）檢測試劑盒、游離脂肪酸（NEFA）檢測試劑盒、微量丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。酶標(biāo)儀，為美國Thermo公司產(chǎn)品。

1.3 云芝多糖組分的分離

采用分步醇沉的方法將云芝多糖分為3個(gè)組分，0～43%乙醇沉淀組分，命名為PSK-1；43%～50%乙醇沉淀組分，命名為PSK-2；50%～80%乙醇沉淀組分，命名為PSK-3。

云芝多糖組分得率=分離組分質(zhì)量/云芝多糖干重×100%。

1.4 分子量分布檢測

采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）[6]測定云芝胞內(nèi)糖肽分步醇沉各組分的分子量。利用重均分子量（Mw）為2 000 kDa、133.8 kDa、41.1 kDa、21.4 kDa、4.6 kDa和0.18 kDa的葡聚糖和GPC軟件做出葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程算出樣品的分子量。

1.5 小鼠模型

小鼠模型采用NIAAA模型，具體操作流程參見美國國立衛(wèi)生院酒精濫用與酒精中毒研究所（National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, NIAAA）肝病研究室新建立的ALD模型[7]。小鼠適應(yīng)環(huán)境至少1周后隨機(jī)分組，正常組（CON）、模型組（EtOH）、陽性對照組（BP，150 mg/kg?d）、PSK-1低高劑量組（200和400 mg/kg?d）、PSK-2低高劑量組（200和400 mg/kg?d）和PSK-3低高劑量組（200和400 mg/kg?d），共9組，每組6只。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析方法

結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析，然后進(jìn)行Newman-Keuls檢驗(yàn)。所有分析均使用GraphPad Prism 5進(jìn)行，如果p值低于0.05，則認(rèn)為結(jié)果是有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的。

2 結(jié)果與分析

2.1 云芝多糖組分分離得率

由表1可知，云芝多糖經(jīng)過分級醇沉得到3個(gè)多糖組分，分別為PSK-1，PSK-2和PSK-3。共使用577 g云芝多糖，經(jīng)分離后的各組分得率分別為：29.10 %，8.81 %和28.38 %。

2.2 分子量分布

由圖1可以看出，經(jīng)過分級醇沉后的各組分分子量分布存在明顯差異。其中PSK-1有兩個(gè)峰，其重均分子量為40 248 Da和1 396 Da；PSK-2也具有兩個(gè)峰，其重均分子量為14 695 Da和905 Da；PSK-3為單峰，重均分子量為3 395 Da。以上結(jié)果表明隨著乙醇濃度的增加，分離出的多糖的分子量減小。

表1 云芝多糖分離組分產(chǎn)量及得率

注：數(shù)據(jù)以3次平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

圖1 云芝多糖分離組分PSK-1（A）、PSK-2（B）和PSK-3（C）的重均分子量分布

圖2 云芝多糖分離組分對小鼠體重變化率的影響

2.3 小鼠體重變化率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在將飼料更換為Lieber-DeCarli正常液體飼料時(shí)小鼠的體重出現(xiàn)小波動(dòng)（圖2）。小鼠喂食含5%（/）酒精的Lieber-DeCarli酒精液體飼料后，小鼠體重均有不同程度的下降。正常組小鼠繼續(xù)喂食等熱量的Lieber-DeCarli正常液體飼料后，小鼠體重穩(wěn)定增長。表明酒精的攝入會造成小鼠體重的持續(xù)下降。但分級醇沉后的云芝多糖組分并未改善這種現(xiàn)象。

2.4 小鼠肝功能血清指標(biāo)

血清中ALT和AST水平常被用作衡量酒精引起的肝臟損傷的生化指標(biāo)[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠的血清中ALT和AST水平明顯上升（<0.05）（圖3）；云芝多糖經(jīng)過分級醇沉后得到的3個(gè)組分中PSK-1高低劑量組和PSK-2高劑量組能夠顯著降低小鼠血清中ALT和AST水平（<0.05）；PSK-3并沒有表現(xiàn)出對小鼠血清中ALT和AST水平的調(diào)節(jié)作用。

2.5 小鼠血脂指標(biāo)

血脂異常是以TC、TG、LDL-C水平升高以及HDL-C水平降低為特征的異常脂質(zhì)代謝，是代謝綜合征的一個(gè)組成部分[9]，也是心血管疾病的強(qiáng)預(yù)測因子[10;11]。結(jié)果顯示，小鼠長時(shí)間飲食酒精會引起血清中TC、TG、LDL-C的顯著上升，HDL-C的顯著下降，造成血脂異常（圖4）。云芝多糖分離的3個(gè)組分中PSK-1高低劑量組均表現(xiàn)出良好的調(diào)節(jié)作用，能夠顯著的降低小鼠血清中TC、TG、LDL-C的水平，提高HDL-C的水平。

2.6 小鼠肝組織中MDA和NEFA

MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其水平的高低間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受到自由基攻擊的嚴(yán)重程度[12]。結(jié)果顯示，小鼠長期飲食酒精會造成肝組織中MDA顯著升高（<0.05），PSK-1和PSK-2的高低劑量組均能夠顯著的降低肝組織中MDA的水平（<0.05）。表明PSK-1和PSK-2能夠減少小鼠肝組織中的脂質(zhì)過氧化程度。NEFA是中性脂肪的分解產(chǎn)物，其水平的上升與脂類的代謝關(guān)系密切[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，長期飲食酒精會造成小鼠NEFA水平的顯著上升（<0.05），而PSK-1能夠有效地抑制NEFA的上升（<0.05）。表明PSK-1能夠調(diào)節(jié)小鼠肝組織中的脂類代謝。

數(shù)據(jù)為平均值±SD（n=6）；與正常組相比##P<0.01；與模型組相比**P<0.01。

A：TC，B：TG，C：LDL-C，D：HDL-C；數(shù)據(jù)為平均值±SD（n=6）；與正常組相比##P<0.01；與模型組相比*P<0.05，**P<0.01。

3 小 結(jié)

利用0～43%、43%～50%、50%～80%體積分?jǐn)?shù)的乙醇沉淀云芝多糖，得到PSK-1、PSK-2和PSK-3三個(gè)組分。在NIAAA模型上，三個(gè)組分中PSK-1（400 mg/kg）具有較好的抗酒精誘導(dǎo)小鼠肝損傷、血脂異常和脂類代謝異常的活性，能夠顯著降低ALT、AST、TC、TG、LDL-C、MDA和NEFA的水平；同時(shí)提升LDL-C的水平，說明PSK-1是云芝多糖中抗ALD的主要活性成分。GPC檢測結(jié)果顯示，PSK-1并不是均一組分，因此有必要對其進(jìn)一步開展分離純化及保肝活性機(jī)制的研究。

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Hepatoprotective test of polysaccharide fromon alcoholic liver injury mice

Wang Kangle1Lu Zhenming2*Chen Lu1Geng Yan1Xu Hongyu2Xu Guohua4Shi Jinsong1Xu Zhenghong2, 3

(1. School of Pharmaceutical Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 3. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 4. Jiangsu Shenhua Pharmaceutical Co. Ltd, Huai’an 211600, China.)

The PSK-1, PSK-2 and PSK-3 were separated by step-alcohol precipitation fromPolysaccharides (PSK). And then evaluated the anti-alcohol liver injury activites through the NIAAA mouse model.The results showed that PSK-1 (400 mg/kg) significantly reduced alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), triglyceride (TG), total cholesterol (TC), low-density lipoprotein sterols (LDL-C) in serum, malondialdehyde (MDA) and nonesterified fatty acid (NEFA) in tissues, while raised the level of high-density lipoprotein sterols (HDL-C).The active of other two components are lower. It was shown that PSK-1 has the best hepatoprotective activity in the three components.

polysaccharide; step-alcohol precipitation; liver function; blood lipid; activity evaluation

S567.3+1

A

2095-0934（2018）04-235-05

國家自然科學(xué)基金（31401931）

王康樂（1991—），男，在讀碩士，研究方向?yàn)樗幨秤谜婢嗵恰?/p>

陸震鳴（1981—），副教授。E-mail：zmlu@jiangnan.edu.cn。