段分分，楊雯雯，邵云俠，王 坤，吳永貴

作為糖尿病患者臨床常見的一種微血管并發(fā)癥，糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)已受到學者的廣泛關注。研究[1-2]表明巨噬細胞活化介導的腎內(nèi)炎癥在DN發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)是模式識別受體，負責啟動炎癥反應和免疫應答，研究[3]顯示其家族成員 Toll受體 2 (Toll-like receptor 2，TLR2)參與了DN持續(xù)炎癥反應，加重DN腎組織損傷。因此，探討干擾或阻斷TLR2信號傳導通路的藥物，有助于防治DN的發(fā)展。芍藥苷(paeoniflorin, PF)是白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)的主要生物活性成分，研究[4]顯示PF可抑制糖尿病大鼠腎組織炎癥反應，減輕腎臟損害。該研究擬探討PF對DN發(fā)揮腎臟保護作用的機制與TLR2信號通路相關，為DN的進一步診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康雄性8～10周齡C57BL/6J同窩野生型小鼠60只，18～20 g，TLR2-/-小鼠24只，均購自南京大學動物模式中心。進入安徽醫(yī)科大學SPF級動物房前檢疫1周，合格后進入飼養(yǎng)室。飼養(yǎng)室12 h交替照明、溫度(22±2)℃，相對濕度(55±5)%。

1.2藥品與主要試劑PF (南京廣潤生物制品公司)；鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(美國Sigma公司)；糖原染液D004(南京建成生物工程研究所)；通用二步法試劑盒PV-9000、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)；Reverse Transcription System A3500(美國 Promega公司)；兔抗CD68、TLR2、髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)、誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)抗體(美國Abcam公司)；兔抗磷酸化核因子κB p65(phospho-nuclear factor kappa B p65，NF-κB p-p65)、核因子κB p65(nuclear factor kappa B p65，NF-κB p65)抗體(美國Cell Signaling公司)；兔抗磷酸化白介素受體相關激酶-1(phospho-IL-1 receptor-associated kinase-1,p-IRAK-1)抗體(美國Santa Cruz公司)；鼠抗β-actin、HRP羊抗鼠IgG、HRP羊抗兔IgG抗體(武漢三鷹公司)；ECL試劑盒、TRIzol Reagent(美國Thermo Scientific公司)；BCA試劑盒(上海碧云天公司)。

1.3方法

1.3.1動物模型建立及分組 C57BL/6J及TLR2-/-小鼠連續(xù)5 d腹腔注射STZ 50 mg/kg，一周后使用血糖儀測小鼠尾靜脈的隨機血糖，以血糖大于16.7 mmol/L者作為糖尿病模型，同時對照組給予同等劑量的枸櫞酸溶液。

動物分組：C57BL/6J對照組(Control)；模型組(DM)；PF干預低劑量組[STZ+PF 25 mg/(kg·d)]；PF干預中劑量組[STZ+PF 50 mg/(kg·d)]；PF干預高劑量組[STZ+PF 100 mg/(kg·d)]；TLR2-/-對照組(TLR2-/-)；TLR2-/-模型組(TLR2-/-+STZ)。每組各12只。PF采取腹腔注射，每天一次至12周。其余組給予同等劑量的生理鹽水。

1.3.2實驗標本收集 小鼠標準喂養(yǎng)，實驗12周末將各組小鼠取出后置于代謝籠中，收集24 h的尿液，留作24 h尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate，UAER)測定。麻醉后稱體重并記錄，眼球取血，分離血清，用于測定血糖。取腎后去腎包膜及腎周脂肪，稱重并記錄腎重，一側(cè)腎臟放至凍存管中，置于液氮，留作后續(xù)Western blot及RT-PCR檢測。另側(cè)腎臟經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋用于PAS染色及免疫組化檢測。

1.3.3病理形態(tài)學觀察 PAS染色光學顯微鏡下隨機選取10個視野的腎小球和腎小管間質(zhì)，進行腎小球系膜擴張指數(shù)和腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評分。腎小球評分：正常腎小球為0，系膜基質(zhì)增生面積<25%為1，25%～50%為2，51%～75%為3，>75%為4。腎小管間質(zhì)損傷評分標準：正常腎小管間質(zhì)為0，腎小管萎縮、擴張伴管型形成、間質(zhì)炎性反應與纖維化面積<25%為1，25%～50%為2，>50%為3。腎小球系膜擴張指數(shù)和腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評分即為切片組織評分的平均值。

1.3.4免疫組織化學 石蠟切片常規(guī)脫蠟處理，流水沖洗1 min，滴加3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，切片置于枸櫞酸鈉溶液液中微波下行抗原修復，山羊血清封閉10 min以消除非特異染色，PBS洗滌后，分別滴加一抗CD68(1 ∶50)、TLR2(1 ∶250)、NF-κB p65(1 ∶600)，同時滴加PBS溶液于陰性對照中，4 ℃封閉過夜，滴加PV9000試劑1室溫孵育20 min，隨后滴加PV9000試劑2室溫孵育30 min，隨后滴加DAB顯色液。在顯微鏡下控制切片的著色時間，隨后復染、脫水、透明、封片。光學顯微鏡下每組切片隨機選取10個視野采集圖片，使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0進行半定量分析，測定各組腎小球和腎小管間質(zhì)中的CD68陽性細胞數(shù)目，以及TLR2、NF-κB p65的陽性面積百分比，統(tǒng)計比較各組的平均值。

1.3.5RT-PCR法檢測各組腎組織的mRNA的表達 采用TRIzon法提取各組腎組織總的RNA，并檢測RNA純度，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。RT-PCR采用SYBR Green法，GAPDH作為校正內(nèi)參，用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達。引物均由上海生工生物工程公司合成，引物包括腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)。引物序列見表1。

表1 各引物序列

1.3.6Western blot法檢測各組腎組織蛋白的表達 將各組腎組織取出適量置于冰上裂解，提取總蛋白。取40 μg蛋白樣品上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉，加一抗TLR2(1 ∶1 000)、MyD88(1 ∶250)、p-IRAK-1(1 ∶200)、IRF3(1 ∶1 000)、NF-κB p-p65(1 ∶1 000)、NF-κB p65(1 ∶1 000)、iNOS(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶35 000) ，4 ℃孵育過夜，加入相應二抗(1 ∶8 000)，室溫孵育45 min，ECL發(fā)光試劑盒顯影、成像。用Image J軟件對Western blot條帶進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠一般指標變化12周末DM小鼠血糖、腎重/體重、UAER明顯高于Control及TLR2-/-組小鼠(P<0.05，P<0.01)；與DM組比較，STZ+PF[25、50、100 mg/(kg·d)]及TLR2-/-+STZ組小鼠血糖差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但STZ+PF[25、50、100 mg/(kg·d)]及TLR2-/-+STZ組小鼠體重/腎重、UAER 水平明顯減低(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.2腎組織病理學改變光鏡下觀察顯示，與Control組小鼠比較，TLR2-/-組小鼠PAS染色差異無統(tǒng)計學意義，DM組系膜擴張指數(shù)及腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評分明顯高于Control組(P<0.01)；與DM組比較，STZ+PF[25、50、100 mg/(kg·d)]及TLR2-/-+STZ組小鼠腎組織病理改變明顯減輕，系膜擴張指數(shù)(F=238.6，P<0.01)及腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評分顯著降低(F=251.5，P<0.01)。見圖1。

2.3腎組織CD68、TLR2及NF-κBp65免疫組化改變免疫組化結(jié)果顯示，Control及TLR2-/-組小鼠的腎小球及腎小管間質(zhì)中CD68陽性巨噬細胞浸潤較少,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，DM組腎小球及腎小管間質(zhì)中CD68陽性細胞浸潤較Control組明顯升高(P<0.01)，STZ+PF[25、50、100 mg/(kg·d)]與DM組比較，CD68表達明顯減低，差異有統(tǒng)計學意義(F腎小球=540.8、F腎小管間質(zhì)=89.36，P<0.01)，見圖2。TLR2主要表達于腎小管上皮細胞胞質(zhì)中，Control組TLR2僅少量表達，TLR2-/-組幾乎不表達，而DM組腎小管上皮細胞胞質(zhì)中TLR2表達較Control明顯增加(P<0.01)，STZ+PF[25、50、100 mg/(kg·d)]中上調(diào)的TLR2表達明顯受到抑制(F腎小管間質(zhì)=507.8，P<0.01)，各組小鼠腎小球 TLR2表達差異無統(tǒng)計學意義(F腎小球=15.58，P>0.05)，見圖3。Control及TLR2-/-組腎組織僅有少量NF-κB p65表達，DM組腎小球及腎小管間質(zhì)中NF-κB p65表達明顯高于Control(P<0.01)，STZ+PF[25、50、100 mg/(kg·d)]與DM組相比，NF-κB p65表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(F腎小球=827.4，F(xiàn)腎小管間質(zhì)=725.6，P<0.01)，見圖4。

圖1 各組小鼠腎組織病理學改變 PAS×400

A：腎小球系膜擴張指數(shù)；B：腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)；1：Control組；2：DM組；3：STZ+PF 25 mg/(kg·d)組；4：STZ+PF 50 mg/(kg·d)組；5：STZ+PF 100 mg/(kg·d)組；6：TLR2-/-組；7：TLR2-/-+STZ組；與Control組比較：**P<0.01；與DM組比較：##P<0.01

圖2 各組小鼠腎組織CD68的表達 PV二步法×400

A：腎小球CD68陽性細胞數(shù)；B：腎小管間質(zhì)CD68陽性細胞數(shù)；1：Control組；2：DM組；3：STZ+PF 25 mg/(kg·d)組；4：STZ+PF 50 mg/(kg·d)組；5：STZ+PF 100 mg/(kg·d)組；6：TLR2-/-組；7：TLR2-/-+STZ組；與Control組比較：**P<0.01；與DM組比較：##P<0.01

表2 各組小鼠一般指標變化

與Control組比較：*P<0.05，**P<0.01；與DM組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4各組小鼠腎組織TNF-α、IL-1β和MCP-1的mRNA表達與Control組比較，DM組小鼠腎組織中TNF-α、IL-1β和MCP-1的mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.01)，TLR2-/-組小鼠上述指標表達則明顯下降(P<0.05，P<0.01)；與DM組比較，STZ+PF[25、50、100 mg/(kg·d)]及TLR2-/-+STZ組小鼠TNF-α、IL-1β和MCP-1表達均明顯下降(P<0.01)。各指標組間差異具有統(tǒng)計學意義(FTNF-α=237.7、FIL-1β=136.6、FMCP-1=63.07，P<0.01)。見圖5。

圖3 各組小鼠腎組織TLR2的表達 PV二步法×400

A：腎小球TLR2陽性面積百分比；B：腎小管間質(zhì)TLR2陽性面積百分比；1：Control組；2：DM組；3：STZ+PF 25 mg/(kg·d)組；4：STZ+PF 50 mg/(kg·d)組；5：STZ+PF 100 mg/(kg·d)組；6：TLR2-/-組；7：TLR2-/-+STZ組；與Control組比較：**P<0.01；與DM組比較：##P<0.01

2.5各組小鼠腎組織TLR2、MyD88、p-IRAK-1、NF-κBp-p65、NF-κBp65、iNOS蛋白表達Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，DM組小鼠TLR2、MyD88、p-IRAK-1、NF-κB p-p65、NF-κB p65、iNOS的蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)，TLR2-/-組小鼠上述指標蛋白表達則明顯下降(P<0.01)；與DM比較，STZ+PF[25、50、100 mg/(kg·d)]及TLR2-/-+STZ組小鼠TLR2、MyD88、p-IRAK-1、NF-κB p-p65、NF-κB p65、iNOS的蛋白表達受到抑制(P<0.05，P<0.01)。各指標組間差異具有統(tǒng)計學意義(FTLR2=168.1、FMyD88=123.6、Fp-IRAK-1=21.11、FNF-κB p-p65=880.3、FNF-κB p65=92.93、FiNOS=23.17，P<0.05，P<0.01)。見圖6～7。

3 討論

DN作為一種長期并發(fā)癥，預防其進展仍然是一個重要挑戰(zhàn)。蛋白尿是腎臟疾病進展的主要危險因素[5-6]，測定UAER可評價糖尿病治療效果[5,7]，其值降低代表明顯的腎臟保護作用。本研究結(jié)果表明PF干預及TLR2基因敲除均可降低糖尿病小鼠UAER，減輕腎臟組織病理損傷，提示了PF及TLR2基因敲除對糖尿病小鼠腎臟有保護作用。

TLR2信號通路與DN腎組織持續(xù)的微炎癥狀態(tài)有關。TLR2是Toll樣受體家族一員，是配體激活的膜結(jié)合受體，其可通過MyD88依賴途徑激活NF-κB入核，導致TNF-α、MCP-1等炎性細胞因子上調(diào)，促進炎癥反應[3]。Li et al[8]研究表明在STZ誘導的糖尿病小鼠腹腔注射TLR2激動劑Pam3CysSK4可上調(diào)TLR2-MyD88-NF-κB的表達，增加MCP-1的分泌，加重腎臟損傷。本研究DM組小鼠腎組織中TLR2、NF-κB p65信號被激活，促炎因子TNF-α、IL-1β和MCP-1表達增加，TLR2、MyD88、p-IRAK-1、NF-κB p-p65和NF-κB p65的蛋白表達顯著上調(diào)，而敲除TLR2基因則明顯減弱了上述情況[9]。同時，本研究DM組小鼠腎組織觀察到有大量巨噬細胞(CD68陽性細胞)浸潤，且巨噬細胞活化以M1型為主，其標志物iNOS表達上調(diào)。

圖4 各組小鼠腎組織NF-κB p65的表達 PV二步法×400

A：腎小球NF-κB p65陽性面積百分比；B：腎小管間質(zhì)NF-κB p65陽性面積百分比；1：Control組；2：DM組；3：STZ+PF 25 mg/(kg·d)組；4：STZ+PF 50 mg/(kg·d)組；5：STZ+PF 100 mg/(kg·d)組；6：TLR2-/-組；7：TLR2-/-+STZ組；與Control組比較：**P<0.01；與DM組比較：##P<0.01

圖5 各組小鼠腎組織TNF-α、IL-1β和MCP-1的mRNA表達

1：Control組；2：DM組；3：STZ+PF 25 mg/(kg·d)組；4：STZ+PF 50 mg/(kg·d)組；5：STZ+PF 100 mg/(kg·d)組；6：TLR2-/-組；7：TLR2-/-+STZ組；與Control組比較：*P<0.05，**P<0.01；與DM組比較：##P<0.01

圖6 各組小鼠腎組織TLR2、MyD88、p-IRAK-1、iNOS的蛋白表達

1：Control組；2：DM組；3：STZ+PF 25 mg/(kg·d)組；4：STZ+PF 50 mg/(kg·d)組；5：STZ+PF 100 mg/(kg·d)組；6：TLR2-/-組；7：TLR2-/-+STZ組；與Control組比較：**P<0.01；與DM組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖7 各組小鼠腎組織NF-κB p-p65、NF-κB p65的蛋白表達

A：NF-κB p-p65； B：NF-κB p65；1：Control組；2：DM組；3：STZ+PF 25 mg/(kg·d)組；4：STZ+PF 50 mg/(kg·d)組；5：STZ+PF 100 mg/(kg·d)組；6：TLR2-/-組；7：TLR2-/-+STZ組；與Control組比較：**P<0.01；與DM組比較：##P<0.01

而敲除TLR2基因后腎組織中棕染的CD68明顯減少，iNOS表達受到抑制。眾所周知，DN的發(fā)展與炎癥關系密切，其中巨噬細胞浸潤是DN特征性表現(xiàn)之一[2,10]。研究[9-10]顯示DN腎組織中浸潤的巨噬細胞主要是M1型，M1型巨噬細胞能產(chǎn)生大量炎性細胞因子，促進組織損傷。Shao et al[11]研究顯示TLR2-/-可減輕由高糖誘導的骨髓來源巨噬細胞向M1型活化及炎癥因子的產(chǎn)生。由此證明TLR2可通過MyD88依賴性途徑調(diào)節(jié)巨噬細胞聚集和激活。采取有效針對性地抑制DN中TLR2的過度表達可阻礙DN的發(fā)展。 TGP目前已經(jīng)廣泛應用于各種疾病如紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎的治療，PF是TGP的主要活性成分[12]。研究[13-14]表明TGP可抑制腎小球和腎小管間質(zhì)巨噬細胞TLR2和TLR4的表達，TGP有明顯的腎臟保護作用。目前PF對DN保護作用的具體機制尚不明確。Shao et al[11]采用體外研究發(fā)現(xiàn)PF可通過TLR2信號通路抑制高糖誘導的巨噬細胞活化，減輕TNF-α、IL-1β和MCP-1的表達。本研究PF干預顯示出與TLR2基因敲除相同的治療效果，PF干預可降低24 h UAER，減輕糖尿病小鼠腎臟損傷，阻斷腎組織中NF-κB p65活化和巨噬細胞募集，抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的表達，與Fu et al[4]研究結(jié)果相一致。同時，PF可以抑制糖尿病小鼠腎組織中TLR2水平的升高，降低下游通路MyD88、p-IRAK-1的表達。說明PF可能部分通過抑制TLR2信號通路而發(fā)揮對DN的腎臟保護作用。PF對其他Toll受體信號通路的作用有待進一步研究。

綜上所述，PF可通過抑制糖尿病小鼠TLR2的表達阻止巨噬細胞活化，減輕炎癥反應從而發(fā)揮腎臟保護作用，為DN患者PF治療提供了支持性證據(jù)。