謝小麗，李 俊

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種致死率極高的組織結(jié)構(gòu)破壞性肺疾病。其病程包括肺泡上皮細(xì)胞損傷、異常增生、炎性細(xì)胞積聚，成纖維細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)沉積及瘢痕組織形成。因其死亡率高于大多數(shù)腫瘤，平均診斷生存期僅2.8年[1]，是典型的“類腫瘤疾病”[2]。美國(guó)胸科學(xué)會(huì)和歐洲呼吸學(xué)會(huì)推薦的聯(lián)合治療包括皮質(zhì)激素和硫唑嘌呤或環(huán)磷酰胺，但目前臨床缺乏足夠療效證據(jù)。5,7,3’-三乙酰橙皮素(5,7,3'-triacetyl hesperidin，TAHP)為橙皮苷的結(jié)構(gòu)衍生物，研究[3]顯示其具有改善微循環(huán)、抗炎免疫、抗氧化等多重功效。該實(shí)驗(yàn)采用博來(lái)霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化，觀察TAHP對(duì)模型大鼠的治療作用并探索其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠120只，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2藥品與試劑 博來(lái)霉素(bleomycin A5, BLM)購(gòu)自哈爾濱博萊制藥有限公司，批號(hào)：1108422，以生理鹽水配成1 g/L溶液；TAHP由橙皮苷(云南藥物研究所提供)合成并純化，純度>90%；醋酸地塞米松(dexamethasone, DXM)片購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：1109110；羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.1.3儀器 uQuant全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek公司；DL-5000B低速冷凍離心機(jī)購(gòu)自上海安亭公司；高速冷凍離心機(jī)、Mastercycler. Ep型梯度PCR儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；Power-Pac HC型電泳儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；GSG2000Ⅱ型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自珠海黑馬公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 大鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組：對(duì)照組、模型組、TAHP組(50、100、200 mg/kg)及陽(yáng)性藥DXM 組(1.4 mg/kg)。

1.2.2模型建立 除對(duì)照組外，其余各組氣管內(nèi)一次性滴注博來(lái)霉素(5 mg/kg)復(fù)制大鼠肺纖維化模型，對(duì)照組用生理鹽水代替。造模后第2天開(kāi)始灌胃給藥，每日一次，對(duì)照組和模型組給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。

1.2.3樣本采集 造模后7、14、28 d大鼠分批麻醉后放血處死，分離肺組織，右肺經(jīng)氣管灌注10%中性甲醛后投入固定液固定用于病理學(xué)檢測(cè)，左肺凍存于-80 ℃冰箱，待測(cè)生化指標(biāo)。

1.2.4組織病理學(xué)觀察 每組隨機(jī)取6只大鼠肺組織固定24 h后，按常規(guī)制作蠟塊、切片后進(jìn)行HE染色和Masson染色。分別對(duì)7、14、28 d肺組織的肺泡炎、肺纖維化程度和膠原蛋白情況進(jìn)行觀察、分析。

1.2.5組織相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè) 按照相應(yīng)ELISA試劑盒操作步驟檢測(cè)組織中HYP、MDA、GSH及SOD的含量。

1.2.6TAHP對(duì)肺纖維化大鼠相關(guān)基因表達(dá)的影響 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、平滑肌肌動(dòng)蛋白α(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)及干細(xì)胞因子受體(c-Kit receptor，c-Kit) mRNA的表達(dá)。PCR引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，PCR擴(kuò)增條件見(jiàn)表2。

表1 PCR引物和擴(kuò)增長(zhǎng)度

2 結(jié)果

表2 PCR反應(yīng)條件

2.1肺組織病理觀察變HE、Masson染色結(jié)果顯示：各對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁未見(jiàn)增厚，間質(zhì)未見(jiàn)膠原沉積。模型組肺泡炎和肺纖維化現(xiàn)象明顯，大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向肺泡腔和肺間質(zhì)浸潤(rùn)，肺間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞積聚、肺泡間隔增寬，出現(xiàn)膠原沉積。且隨著時(shí)間的推移、肺內(nèi)膠原沉積逐漸加重，病變呈現(xiàn)從肺泡炎向纖維化轉(zhuǎn)化趨勢(shì)。DXM組的肺泡炎和肺纖維化程度較模型組減輕。TAHP各劑量組大鼠肺組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域、成纖維細(xì)胞聚集程度和細(xì)胞外膠原沉積面積均較同時(shí)期模型組有所減小，且肺組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，顯示肺泡炎程度和肺纖維化程度較模型組有不同程度的降低，高劑量TAHP組(200 mg/kg)控制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肺纖維化程度與DXM組相當(dāng)。結(jié)果見(jiàn)圖1～3。

2.2TAHP對(duì)肺纖維化大鼠肺組織中MDA、SOD、GSH和HYP含量的影響與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中HYP和MDA含量顯著升高(P<0.05)，GSH和SOD含量顯著降低(P<0.05)；TAHP各劑量組大鼠肺組織中HYP和MDA含量較模型組有不同程度的降低(P<0.05)，GSH和SOD含量較模型組均有提升(P<0.05)，但未呈現(xiàn)明顯劑量相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.3TAHP對(duì)肺纖維化大鼠相關(guān)基因表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中TGF-β1、α-SMA、SCF和c-Kit mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，TAHP中、高劑量給藥組(100、200 mg/kg)均能下調(diào)肺纖維化大鼠肺組織中TGF-β1、α-SMA、SCF和c-Kit的表達(dá)水平(P<0.05)。而TAHP低劑量給藥組(50 mg/kg)對(duì)大鼠肺組織TGF-β1、α-SMA、SCF和c-Kit的表達(dá)水平無(wú)顯著改變。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖1 TAHP治療7 d后各組大鼠肺組織染色 ×200

A：對(duì)照組；B：模型組；C：TAHP 50 mg/kg；D：TAHP 100 mg/kg；E：TAHP 200 mg/kg；F：DXM 1.4 mg/kg；1：HE染色；2：Masson染色

3 討論

目前模仿人類肺纖維化病理特點(diǎn)、動(dòng)物造模的最常用技術(shù)是氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素復(fù)制肺纖維化模型。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠肺組織中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原聚積、纖維組織增生明顯，肺泡間隔不規(guī)律性增寬、部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞、甚至消失，基本符合肺纖維化的解剖學(xué)特點(diǎn)，且反映膠原代謝的HYP含量明顯升高說(shuō)明大鼠肺纖維化模型制備成功。5,7,3’-三乙酰橙皮素能明顯減輕肺纖維化大鼠的肺泡炎和肺纖維化程度、降低肺組織HYP含量等，說(shuō)明5,7,3’-三乙酰橙皮素對(duì)于博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化有一定治療作用。

圖2 TAHP治療14 d后各組大鼠肺組織染色 ×200

A：對(duì)照組；B：模型組；C：TAHP 50 mg/kg；D：TAHP 100 mg/kg；E：TAHP 200 mg/kg；F：DXM 1.4 mg/kg；1：HE染色；2：Masson染色

脂質(zhì)過(guò)氧化是肺纖維化病程中關(guān)鍵的致病因素[4]。本實(shí)驗(yàn)中關(guān)于肺纖維化過(guò)氧化涉及的相關(guān)指標(biāo)包括：SOD作為超氧陰離子自由基的中和劑，可維持機(jī)體的氧化與抗氧化平衡，對(duì)自由基啟動(dòng)的過(guò)氧化反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制作用。測(cè)定SOD可判斷與評(píng)價(jià)機(jī)體自由基損傷程度與自由基清除劑藥物的治療效果。GSH作為一種重要的抗氧化劑，在谷胱甘肽過(guò)氧化酶催化下，其巰基能將細(xì)胞產(chǎn)生的H2O2還原成H2O，且在人類纖維化疾病和動(dòng)物纖維化模型中，GSH含量明顯降低，該值是衡量纖維化疾病程度的重要參數(shù)。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，由機(jī)體內(nèi)氧自由基攻擊細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸產(chǎn)生，該值反映組織過(guò)氧化損傷的程度。結(jié)果顯示：在給予 5,7,3’-三乙酰橙皮素治療后，肺纖維化大鼠組織中的MDA和HYP含量均有不同程度的降低，表明 5,7,3’-三乙酰橙皮素降低了肺纖維化大鼠的氧化損傷程度和膠原蛋白的含量；而給藥組中SOD活力和GSH含量較模型組都有明顯升高，提示 5,7,3’-三乙酰橙皮素可提高肺纖維化大鼠抗氧化損傷的能力。5,7,3’-三乙酰橙皮素的抗脂質(zhì)過(guò)氧化功效為其防治肺纖維化提供藥理學(xué)依據(jù)，但其干預(yù)作用是否呈劑量依賴性還有待進(jìn)一步研究。

圖3 TAHP治療28 d后各組大鼠肺組織染色 ×200

A：對(duì)照組；B：模型組；C：TAHP 50 mg/kg；D：TAHP 100 mg/kg；E：TAHP 200 mg/kg；F：DXM 1.4 mg/kg；1：HE染色；2：Masson染色

肺纖維化是由多種細(xì)胞因子啟動(dòng)、持續(xù)性膠原蛋白代謝失衡造成的結(jié)果。TGF-β1是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的細(xì)胞增殖調(diào)控劑和細(xì)胞外基質(zhì)沉積促進(jìn)劑[5]，研究[6-7]證實(shí)其介導(dǎo)的Smads、ERK信號(hào)通路在肺纖維化中起關(guān)鍵作用。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast, MFb)的標(biāo)志性蛋白[8-9]，其表達(dá)水平可間接反映Fb向MFb轉(zhuǎn)化增殖的程度。在本實(shí)驗(yàn)中，相較于模型組，5,7,3’-三乙酰橙皮素各劑量組均抑制大鼠肺組織中的TGF-β1和α-SMA的表達(dá)，說(shuō)明 5,7,3’-三乙酰橙皮素能降低肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而降低肺纖維化程度。其抑制TGF-β1 mRNA的異常高表達(dá)，可能與其抑制TGF-β1介導(dǎo)的下游信號(hào)通路、從而最終發(fā)揮抗肺纖維化作用有關(guān)。

圖4 TAHP治療7、14、28 d后各組大鼠肺組織中HYP、MDA、GSH和SOD的含量

圖5 大鼠肺組織SCF、c-Kit、TGF-β1和α-SMA mRNA的表達(dá)

M：Marker;1：對(duì)照組；2：模型組；3：TAHP 50 mg/kg組；4：TAHP 100 mg/kg組；5：TAHP 200 mg/kg組；6：DXM 1.4 mg/kg

研究[8-9]表明，SCF/c-Kit信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活與各類細(xì)胞的異常增殖有密切關(guān)系。早期研究證實(shí)的與肺纖維化相關(guān)的ERK信號(hào)途徑、JAK-STAT通路等[10-12]，均為SCF/c-Kit通路激活的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[13]。但SCF/c-Kit通路與肺纖維化的關(guān)系尚缺乏研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組大鼠肺組織中SCF、c-Kit的基因表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，提示SCF/c-Kit通路在博來(lái)霉素致大鼠肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展中被激活。SCF為作用于最早期造血干/祖細(xì)胞的造血細(xì)胞因子，這與已獲證實(shí)的肺肌成纖維細(xì)胞的分化與骨髓祖細(xì)胞招募相關(guān)的結(jié)論相吻合[14-16]。不同劑量 5,7,3’-三乙酰橙皮素的治療使大鼠肺組織的SCF、c-Kit表達(dá)水平有所下降表明：5,7,3’-三乙酰橙皮素可能通過(guò)調(diào)控SCF/c-Kit干預(yù)肺纖維化。

綜上所述，5,7,3’-三乙酰橙皮素對(duì)博來(lái)霉素致大鼠肺纖維化有一定的治療作用，其機(jī)制可能與機(jī)體內(nèi)抗氧化和抑制TGF-β1表達(dá)有關(guān)。結(jié)果顯示SCF/c-Kit信號(hào)通路在博來(lái)霉素致大鼠肺纖維化中被激活，5,7,3’-三乙酰橙皮素對(duì)肺纖維化的干預(yù)作用可能與影響SCF/c-Kit有關(guān)。